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抗磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(PEBP1)的鼠单克隆抗体的制备及应用

王双双  
【摘要】:磷脂酰乙醇胺结合蛋白1(phosphatidylethanolamine binding protein 1)即PEBP1,也称Raf激酶抑制蛋白(raf kinase inhibitor protein, RKIP),属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族,广泛存在于各种不同的生物中,参与了对细胞内多种信号转导通路的调节作用。PEBP1可以与Raf-1结合从而抑制MAPK信号转导通路,并参与了对G蛋白偶联受体信号通路和NF-κB信号通路的调控。PEBP1在膜的生物合成,精子发生,神经发育和细胞凋亡等生理过程中发挥重要作用。2003年Fu et al发现PEBP1可以抑制肿瘤细胞转移,使其成为抗肿瘤领域一个新的热点。目前一致被认为在前列腺癌,乳腺癌,结直肠癌,胃肠道间质瘤,黑色素瘤,卵巢上皮癌中具有抑制肿瘤转移的作用,并且是预后的标志。但是在胰腺癌中的表达以及作用还没有报道。本实验室在前期工作中已经获得大量高纯度的PEBP1蛋白标准品。本课题主要在于抗PEBP1的鼠单克隆抗体的制备及鉴定,双抗体夹心ELISA方法的建立及研究其在胰腺癌组织中的应用。本课题的主要内容及设计如下: 1.抗PEBP1抗体的制备及初步鉴定。 2.双抗体夹心ELISA方法的建立 3.抗PEBP1抗体在胰腺癌组织中的应用。 材料与方法 1.抗PEBP1抗体的制备及初步鉴定: 以纯化的PEBP1蛋白免疫BALB/c小鼠,之后取脾细胞使之与骨髓瘤细胞OUR-1融合。随后通过ELISA筛选阳性杂交瘤,经过三轮的亚克隆,选择4个OD值最高,并且有不同活性的克隆,使用Protein G HP纯化获得抗体。获得抗体之后,进行抗体的初步鉴定,选择高表达和低表达该蛋白的人胰腺癌细胞系,通过Western Blot鉴定该组抗体识别该蛋白的特异性。将GFP-PEBP1转染到NIH3T3细胞中,将其固定,用所制备的抗体进行免疫荧光实验。 2.双抗体夹心ELISA方法的建立 通过ForteBio’s Octet系统选择1对与该蛋白结合力高的抗体做Sandwich ELISA,可以用于进一步快速早期检测和诊断胰腺癌。 3.抗PEBP1抗体在胰腺癌组织中的应用 PEBP1被认为是抑制肿瘤转移的基因,我们在此将抗体用于组织芯片,研究PEBP1在胰腺癌病人和正常人中的表达是否不同。 研究结果 1.成功获得四株单克隆抗体,分别有不同的活性。7F12在Western Blot中可以识别正常的293细胞和部分胰腺癌细胞中的PEBP1. 2.由ForteBio’s Octet系统筛选出一对抗体:4F10和8E2,可以识别PEBP1蛋白的不同的表位,因此这一对抗体可以用于Sandwich ELISA,它们可以检测出PEBP1在ng/ml的水平,经过优化之后可以用于临床实践中测定病人血清,可以进一步快速早期检测和诊断胰腺癌。 3.单克隆抗体4A11在组织芯片中可以检测到在正常的胰腺组织中的PEBP1。而在胰腺癌组织中,PEBP1的表达很低甚至没有。 结论 我们的结果显示PEBP1在正常的胰腺中高表达,而在胰腺癌组织中的表达明显降低或者消失。抗PEBP1的单克隆抗体4A11, 4F10, 7F12和8E2是潜在的临床诊断胰腺癌的试剂。


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