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骨髓间充质干细胞优化移植治疗缺血性疾病的基础研究

李勇  
【摘要】:目的:优化获取大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)并对其进行纯化、鉴定,同时对其生物学特性进行研究,为细胞移植治疗缺血性心血管病奠定基础。 方法:使用骨髓腔冲洗法采集大鼠骨髓,采用贴壁筛选法分离纯化大鼠MSCs,传代扩增,观察细胞形态、生长速度,绘制MSCs的生长曲线。选用第3代骨髓间充质干细胞采用MTT法鉴定MSCs的增殖和自我更新能力;选用第3代MSCs,分别用成脂培养基和成骨培养基定向诱导MSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化,利用油红O和茜素红免疫组化染色鉴定分化后的细胞;流式细胞仪检测细胞CD29、CD34、CD45、CD90的表达,对培养的MSCs进行鉴定。冻存复苏MSCs后观察其存活率和生长状态,观察DiI标记MSCs的效率和对MSCs生长状态的影响。 结果:通过本方法培养的MSCs贴壁生长,呈典型的梭形形状,漩涡状排列。能够被诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞;流式细胞仪检测细胞表型CD44、CD90表达阳性,CD34、CD45表达阴性,符合MSCs的特征。观察细胞生长特性发现:MSCs呈贴壁生长,原代培养9~12d可以达到90%融合,传代后的MSCs增殖速度较原代培养明显增快,第3代的MSCs已基本纯化。冻存1个月和6个月后复苏的MSCs生存率分别为93%和88%,复苏后的细胞生长状态良好。DiI标记MSCs的有效率为100%,标记72h后荧光显色无明显减弱,DiI标记的MSCs的细胞形态和生长状态无明显变化。 结论:采用贴壁细胞分离法可以得到纯化的骨髓MSCs,MSCs具有高度增殖、自我更新和定向分化为脂肪细胞和成骨细胞的能力,而且此方法简便易行。冻存对MSCs生长特性无明显影响。DiI可以有效的标记MSCs细胞膜,并且对MSCs的形态和生长状态无明显影响。 目的:研究在体外实验中辛伐他汀对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖、凋亡、旁分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、细胞迁移和管腔形成功能等生物学行为的影响。 方法:采用全骨髓贴壁培养法培养SD大鼠的骨髓间充质干细胞,取第3代生长良好的细胞用做实验。无血清条件下培养24h后,MSCs于不同剂量浓度(0,0.001,0.01,0.1,1.0μmol/l)的辛伐他汀共培养24h,MTT法检测MSCs的增殖能力,ELISA方法检测MSCs分泌VEGF情况;0.01/μmol/l辛伐他汀、0.01/μmol/l辛伐他汀加50nM wortmannin或单纯培养液在无血清情况下与MSCs共培养24h后,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;在0.01/μmol/l浓度水平上,以Transwell小室观察MSCs的迁移能力,管腔形成实验(tube formation assay)观察MSCs形成管腔的能力。 结果:辛伐他汀在一定浓度范围内(0.001~0.1μmol/l)显著提高了MSCs增殖和旁分泌VEGF的功能(与对照组比较,P﹤0.01)。辛伐他汀浓度在0.01μmol/ l时对MSCs的增殖和分泌功能的影响最为显著,随着药物浓度的加大,MSCs的上述功能呈下降趋势。0.01μmol/l浓度的辛伐他汀能抑制无血清诱导的MSCs凋亡,wortmannin则部分抑制了该抗细胞凋亡能力(P﹤0.05)。结果还显示,0.01μmol/l浓度的辛伐他汀能促进MSCs的迁移能力和管腔形成能力。结论:一定浓度范围(0.001~0.1μmol/l)的辛伐他汀能促进骨髓间充质干细胞增殖,增加其旁分泌作用。较低浓度的辛伐他汀(0.01μmol/l)能抑制MSCs的凋亡,促进其迁移和管腔形成的能力。 目的:骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植是近年来出现的治疗严重缺血性疾病的新方法,他汀类药物能够促进血管新生和抑制MSCs凋亡,本实验研究联合应用辛伐他汀是否可以增强MSCs移植治疗下肢动脉缺血性疾病的效果,并且探讨其可能的机制。 方法:雌性C57BL/6J小鼠40只,结扎右侧股动脉及其分支,制备成小鼠后肢动脉缺血模型,并随机分为四组,每组10只,分别是对照组、MSCs组、辛伐他汀组和联合治疗组。对照组:生理盐水喂饲+生理盐水肌肉注射;MSCs组:生理盐水喂饲+MSCs移植;辛伐他汀组:辛伐他汀喂饲+生理盐水肌肉注射;联合治疗组:辛伐他汀喂饲+MSCs移植。股动脉结扎术后即刻,MSCs组和联合治疗组立即将DiI标记的5×106MSCs分5点注射到右侧后肢的缺血周边区域,对照组和辛伐他汀组只注射生理盐水;辛伐他汀组和联合治疗组给小鼠喂饲辛伐他汀(20mg/kg/d),每日一次,共21天,对照组和辛伐他汀组只喂食生理盐水。股动脉结扎术后即刻、第10d、第21d,用激光多普勒灌注成像仪(laser Doppler perfusion imaging,LDPI)检查患肢血流灌注恢复情况、磷酸碱性酶(AKP)染色检查肌肉毛细血管密度、免疫荧光双染检查MSCs在体内向血管内皮细胞的转化、TUNEL法检测肌肉细胞的凋亡、Western Blot检测VEGF蛋白表达。 结果:在术后第10天,和对照组比较,辛伐他汀组、MSCs组、联合治疗组的激光多普勒血流灌注图像指数(LDPI index)显著升高;在第21天,辛伐他汀组、MSCs组、联合治疗组的LDPI index显示进一步的改善,联合治疗组的LDPI index在4组中最高。毛细血管数目/肌肉纤维的比值在联合治疗组最高,其后依次为MSCs组、辛伐他汀组和对照组。免疫荧光双染显示移植的MSCs可以在体内存活,并且分化为血管内皮细胞,而且细胞数目在联合治疗组显著高于MSCs组(P0.05)。TUNEL阳性细胞的比率,辛伐他汀组、MSCs组、联合治疗组明显低于对照组(P0.01),联合治疗组的TUNEL阳性细胞的比率在4组中最低。Western Blot检测显示联合治疗组组VEGF蛋白最强,其次是MSCs组和辛伐他汀组,对照组最低(P0.05)。 结论:单独应用MSC移植或者辛伐他汀喂食可以明显促进血管新生、侧枝血管形成和增加缺血组织的血流灌注,辛伐他汀联合骨髓间充质干细胞移植能进一步促进小鼠缺血后肢的血管新生。


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