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人类精子中电压依赖性阴离子通道蛋白的基础和临床研究

刘边疆  
【摘要】:本实验室在前期研究人类精子膜表面蛋白功能的工作中发现精子中存在电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channels, VDAC)蛋白的氨基酸序列。目前仅有的少数有关哺乳动物生殖组织和细胞中VDAC的研究报道提示VDAC在精子生成、运动、获能和顶体反应等生理过程中可能发挥重要作用,但是其确切的功能以及发挥作用的分子机制均存在诸多不明之处。查阅文献发现,迄今为止尚没有人类精子中VDAC蛋白存在和功能研究的报道。本研究旨在系统探索成熟人类精子中VDAC蛋白的存在、表达和定位信息,为进一步的功能学研究提供依据;获得体外重组的VDAC各亚型蛋白,为制备VDAC特异性单克隆抗体、研究人类精子中各亚型VDAC蛋白的结构特点和超微结构定位、研究VDAC与精子表面其他蛋白之间可能存在的相互作用提供基础;发现VDAC在人类精子活力和顶体反应等生理过程中可能存在的作用及机制,初步探索人类精子中VDAC蛋白的功能特点;研究VDAC与人类弱精子症发生之间的关系,从另一个角度探索VDAC对精子活力的影响,发现对人类精子中VDAC进行基础研究的临床应用价值。 第一部分成熟人类精子中VDAC的存在、表达和定位研究 为了探索成熟人类精子中VDAC的存在、表达和定位信息,我们设计了编码三种VDAC基因的特异性引物,从人类睾丸cDNA文库中进行PCR扩增;提取成熟人类精子蛋白,运用western blot分析VDAC的蛋白表达;运用免疫荧光技术寻找VDAC蛋白的细胞定位。为了获得体外重组的VDAC各亚型蛋白,我们运用基因克隆和原核表达技术体外表达重组蛋白。结果我们从人类睾丸cDNA文库中扩增出三种VDAC基因的转录产物;在成熟人类精子中发现主要以膜蛋白形式存在、定位于精子鞭毛中段和颈部的VDAC蛋白;获得了含有VDAC1、VDAC2和VDAC3蛋白全长转录基因序列的克隆质粒,成功的体外表达出分子量在34~40kDa之间的三种重组VDAC蛋白,并发现它们以包涵体蛋白的形式存在于原核表达系统中,为下一步大规模制备重组VDAC蛋白完成了必要的技术准备。我们认为VDAC蛋白在睾丸生精过程中合成,最终定位到成熟人类精子鞭毛中段和颈部的质膜中。 第二部分VDAC与成熟人类精子活力和顶体反应关系的研究 为了研究VDAC在成熟人类精子活力和顶体反应过程中可能存在的作用及机制,我们将VDAC抗体与活力正常的成熟人类精子共孵育并体外培养精子,检测抗体孵育对精子的运动参数、胞浆中Ca~(2+)浓度、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)含量以及精子顶体反应发生率的影响。我们发现VDAC抗体孵育后会导致精子活力降低以及胞浆中Ca~(2+)浓度减少,而胞浆中ATP含量和精子顶体反应率没有发生明显变化。我们认为VDAC抗体孵育会干扰精子膜中VDAC蛋白介导的Ca~(2+)跨膜转运和交换,导致精子胞浆中Ca~(2+)浓度降低、活力下降,但是这种Ca~(2+)浓度的变化没有对精子顶体反应的发生产生明显的影响。 第三部分VDAC与弱精子症发生关系的研究 为了研究VDAC与人类弱精子症发生之间的关系,我们分别收集正常精液标本提取活力良好的精子,收集特发性弱精子症患者的精液标本提取活力低下的精子,利用实时荧光定量PCR法检测精子中VDAC的信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid, mRNA)的表达,分析精子活力与VDAC的mRNA表达丰度之间的关系。我们发现精子中存在三种VDAC的mRNA,活力低下精子中VDAC2的mRNA表达丰度明显比活力正常精子为高,而VDAC1和VDAC3的mRNA表达丰度在具有不同活力精子中没有明显差异。我们认为成熟人类精子中VDAC2的mRNA高表达丰度与精子活力低下可能存在密切关系,精子中VDAC尤其是VDAC2基因转录和蛋白表达过程中的异常可能是某些特发性弱精子症发生的原因之一。


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