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软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养构建组织工程软骨的最佳比例

常青  
【摘要】:目的 利用兔关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞(bone marrow messenchymal stemcells,BMSCs)建立共培养系统,探讨关节软骨细胞和BMSCs在体外平面环境下共培养促进软骨细胞外基质表达的最佳比例,以及在体内外三维环境中共培养构建组织工程软骨的最佳比例。方法 1.取新西兰大白兔骨髓,采用密度梯度离心法分离单核细胞,体外贴壁培养,筛选至第2代BMSCs。倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达。同时用成脂诱导培养基(DMEM/F12,10%FBS,1μmol/LDEX、0.5mmol/L IBMX、5mg/L人胰岛素,100μmol/L吲哚美辛),成骨诱导培养基(DMEM/F12,10%FBS,100nmol/L DEX、10mmolβ-磷酸甘油钠、50ug/mlVc)和成软骨诱导培养基(DMEM/F12,10%FBS, 1%ITS+,10ng/mL TGF-β1,0.1μM DEX和50μg/ml Vc)对BMSCs进行定向诱导。利用油红O染色检测成脂诱导效果,利用碱性磷酸酶染色检测成骨诱导效果,利用番红O染色和甲苯胺蓝染色检测成软骨诱导效果。 2.分别分离培养兔关节软骨细胞和兔BMSCs至第2代。实验分为8组,分别为:单纯关节软骨细胞组(C),4:1共培养组(软骨细胞:BMSCs=4:1),2:1共培养组(软骨细胞:BMSCs=2:1),1:1共培养组(软骨细胞:BMSCs=1:1),1:2共培养组(软骨细胞:BMSCs=1:2),1:4共培养组(软骨细胞:BMSCs=1:4),单纯BMSCs诱导分化组(iM,DMEM/F12,10%FBS, 1% ITS+,10ng/mL TGF-β1,0.1μM DEX和50μg/ml Vc)和BMS Cs未诱导组(M)。各组均以相同的细胞总数(10~5)接种于培养皿。分别于共培养后第1周,第2周和第3周,提取标本的mRNA和蛋白质。利用Quantitative real-time RT-PCR和Western blot检测II型胶原和aggrecan的mRNA和蛋白质的表达量,以及I型胶原mRNA的表达量。 3.分别培养扩增兔关节软骨细胞和BMSCs至第2代。待细胞80%融合时消化细胞调整细胞悬液浓度为4×10~7/ml并将两种细胞混合,实验分为8组,设组与第二部分实验相同。将上述各组分别接种于4×4×2mm大小的聚乳酸-聚羟基乙酸支架(PLGA)上,每组种植16个支架,每个支架种植细胞总数(10~7)相同。体外培养8周后,各组均取出8个标本进行大体观察、组织学切片、II型胶原免疫荧光染色以及检测组织标本DNA含量和氨基糖胺多糖(GAG)含量。将剩余标本移植于裸鼠皮下继续培养8周,并在培养结束后进行大体观察、组织学切片、II型胶原免疫荧光染色以及检测组织标本DNA含量和氨基糖胺多糖(GAG)的含量。 结果 1.经密度梯度离心结合贴壁培养传代所得到的细胞形态均一,呈长梭形,接近融合状态时可呈现漩涡样生长。分离传代后的第2代细胞超过98%表达CD44、CD29,仅约5%表达CD34。兔BMSCs成脂,成骨和成软骨诱导培养后,油红O,碱性磷酸酶染色,番红O和甲苯胺蓝染色均为阳性。 2.共培养组aggrecan和II型胶原的表达量在1周,2周和3周时呈现出明显的增长趋势。方差分析显示在mRNA水平第3周时,4:1组、2:1组、1:1组的II型胶原和aggrecan都高于单纯关节软骨细胞组和BMSCs诱导组,其中以2:1组最高(P0.05)。在蛋白质表达水平第3周时2:1组的II型胶原和aggrecan均高于单纯关节软骨细胞组和BMSCs诱导组(P0.05)。 3.在体外和体内环境下培养组织工程软骨标本显示,软骨细胞与BMSCs以2:1混合的共培养组构建出的组织工程软骨体积最大,厚度厚,形态饱满,表面光滑有光泽,弹性好;HE染色可见细胞分布均匀排列紧密,增殖较旺盛,并可见软骨细胞陷窝样结构,细胞被大片细胞外基质包围;番红O染色可见细胞外基质红染,着色深;甲苯胺蓝染色则细胞外基质蓝染,着色为蓝紫色;II型胶原免疫荧光组织化学染色中,细胞外基质发出的红色荧光明亮,并显示出有陷窝状结构;2:1组的GAG/DNA比值高于关节软骨细胞组和其他各组(P0.05)。4:1共培养组和关节软骨细胞组的组织工程软骨质量无明显差异,但差于2:1组。1:1组,1:2组,1:4组的质量随着开始时BMSCs所占比例的增加而下降,体积小,表明不光整,质地较硬,GAG/DNA较低。BMSCs诱导培养组在体外培养构建的工程化软骨与1:1组接近,而在体内培养后构建的工程化软骨与1:4共培养组接近。BMSCs未诱导组在体外培养第5周时支架溶解,细胞流失,未能形成工程化软骨。 结论 我们提取BMSCs的方法操作简便易行,所获取的细胞符合BMSCs的特点。在体外单层平面环境下,共培养兔关节软骨细胞和BMSCs在一定比例范围内能促进关节软骨细胞外基质的表达,其中以兔软骨细胞和BMSCs按2:1的比例混合培养促进aggrecan和II型胶原的效果最为明显。在体内和体外环境下构建的组织工程软骨,仍以2:1的比例混合后共培养所构建的组织工程软骨质量最好。


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