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依达拉奉对脊髓缺血再灌注损伤保护作用的机制研究

张爱梁  
【摘要】:脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemic reperfusion injury)是椎管狭窄症手术减压术后、腹主动脉瘤或胸腹主动脉瘤行手术修补术后的一灾难性并发症。脊髓缺血再灌注损伤是脊髓缺血引起的原发性脊髓损伤后的继发性损害,也是造成神经细胞损伤加重的一个重要因素。它是指一些导致脊髓缺血因素去除后,脊髓恢复血供,神经功能不仅得不到改善,反而在原缺血损伤基础上进一步加重,甚至出现不可逆性脊髓神经元迟发性死亡的现象。脊髓缺血再灌损伤可以引起不同程度的神经功能障碍,甚至截瘫及死亡,严重威胁着人类的健康和生命。 尽管调节脊髓缺血再灌注后神经细胞死亡的确切机制仍不明确,但近来有研究表明星形胶质细胞(Astrocyte,Ast)在脊髓缺血再灌注中保护神经元方面起着重要作用。Ast是中枢神经系统中含量最多的细胞,在神经元存活、突触形成、神经再生和神经元修复等方面发挥重要作用~[1, 2]。Ast与神经元之间存在复杂的相互作用,在维持神经系统内环境的稳定及保证神经元的活性方面起到重要作用;Ast与血管内皮细胞及神经元共同组成神经血管单位( The Neurovascular Unit),调节中枢血流量及维持血脑屏障的完整性,对中枢缺血损伤有重要的保护作用,能减轻包括脊髓在内的中枢神经系统缺血后神经元损伤。因此,维持Ast的正常功能,抑制Ast的凋亡,是神经保护的重要策略。 在脑缺血性中风的研究中,缺血再灌注导致的缺血缺氧、葡萄糖缺乏、ATP耗竭、氧化应激及Ca2+稳态破坏从而引起内质网功能障碍,触发内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。ERS反应时内质网膜上的3种跨膜蛋白如PERK(pancreatic ER kinase (PKR)-like ER kinase), Irel (inositol-requiring enzyme 1)和ATF6 (activating transcription factor 6)可以感知应激信号并由内质网膜向胞质和胞核转导。过度ERS则诱导细胞凋亡而加重缺血再灌注诱导的神经细胞损伤。过度或长时间的ERS反应时,内质网稳态不能重新建立,从而启动凋亡信号通路。 氧化应激是指活性氧族(reactive oxygen species,ROS)生成与抗氧化防御系统之间的不平衡状态,可在ROS生成超过抗氧化防御系统时或者在抗氧化剂活性降低时发生,氧化应激和中枢神经系统缺血再灌注损伤疾病密切相关。星形胶质细胞在脑内ROS的清除过程中发挥着重要作用。因此在中枢神经系统缺血再灌注损伤疾病中,星形胶质细胞抗氧化能力下降及其发生的氧化应激损伤,都会加剧病程的发展。 文献研究显示氧葡萄糖血清剥脱/再恢复( oxygen-glucose-serum deprivation/restoration, OGSD/R)能够诱导脊髓来源的星形胶质细胞的凋亡,其主要途径是经过死亡受体途径和线粒体途径,我们推断内质网应激(ERS)是否参与了OGSD/R诱导的脊髓星形胶质细胞凋亡的过程?氧化应激和内质网应激在很多病理生理过程中同时存在,并且是一个恶性循环。如果内质网应激(ERS)参与了OGSD/R诱导的脊髓星形胶质细胞凋亡,我们是否可以利用氧自由基清除剂(Eda),减少ROS的形成,部分缓解内质网应激,减少凋亡的发生?目前尚没有相关研究报道。因此,本文工作的研究目的:1、内质网应激(ERS)是否参与了OGSD/R诱导的脊髓星形胶质细胞凋亡;2、Eda对OGSD/R诱导的星形胶质细胞凋亡和抗氧化能力的影响,以及对内质网应激(ERS)的调节。 第一部分 脊髓来源星形胶质细胞的原代培养和鉴定 目的:体外分离培养鉴定脊髓来源的星形胶质细胞,获取较高纯度脊髓星形胶质细胞的方法。 方法:取SD新生大鼠(1-2天),碘伏消毒,断头处死,切开皮肤皮下,用显微外科镊打开全长椎板,取出脊髓,小心去除硬脊膜,在0.25%胰酶消化成细胞悬液后, 10%的胎牛血清的DMEM培养液终止消化。1500rpm离心5分钟后,按5×10~5个细胞/ml的密度接种到多聚赖氨酸包被的培养瓶内。置于37℃、5% CO_2细胞培养箱中培养。 结果:经密度梯度离心结合贴壁培养传代所得到的细胞形态、状态良好。所分离的脊髓星形胶质细胞采用免疫荧光GFAP和DAPI双染的方法行鉴定,结果超过95%的细胞胞浆区染色呈阳性。 结论:脊髓来源星形胶质细胞的体外分离、提取和培养操作简便易行,所获取的脊髓来源星形胶质细胞纯度高。可以用于下一步实验研究。 第二部分 内质网应激参与脊髓星形胶质细胞氧葡萄糖血清剥脱/再恢复诱导的凋亡 目的:研究氧葡萄糖血清剥脱/再恢复( oxygen-glucose-serum deprivation/restoration, OGSD/R)诱导脊髓来源的星形胶质细胞内质网应激相关凋亡机制。 方法:原代培养大鼠脊髓来源的星形胶质细胞,并采用免疫细胞化学的方法行鉴定。应用Hoechst 33342荧光染色检测细胞的凋亡和CCK8检测试剂盒检测细胞活性;应用免疫细胞化学的方法检测p-eIF2α等内质网应激相关蛋白表达的定性和定位;应用Western—blotting法检测PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、ATF4、caspase-12、caspase-3的水平变化。 结果:1)氧葡萄糖血清剥脱/再恢复能够诱导脊髓来源的星形胶质细胞的凋亡,氧葡萄糖血清剥脱再恢复加重脊髓来源的星形胶质细胞的损伤,导致凋亡增多。2) caspase-3和caspase-12在氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(OGSD/R)诱导的脊髓星形胶质细胞中活化;在正常未处理的脊髓星形胶质细胞中cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-12表达非常低,在给予氧葡萄糖血清剥脱(OGSD)后,cleaved-caspase-3和cleaved-caspase-12的表达明显增加,而给予氧葡萄糖血清再恢复后导致cleaved- caspase-3和cleaved-caspase-12表达进一步增加;3)采用免疫荧光双标的方法观察在给予氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(OGSD/R),前后p-eIF2α在脊髓星形胶质细胞中变化,结果发现在正常未处理的脊髓星形胶质细胞胞浆区p-eIF2α几乎不表达。而给予氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(OGSD/R)后,脊髓星形胶质细胞胞浆区p-eIF2α表达明显增强; 4) PERK/eIF2α/ATF4通路在氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(OGSD/R)过程中活化。在正常未处理的脊髓星形胶质细胞中p-PERK、p-eIF2α的表达很低。而给予氧葡萄糖血清剥脱(OGSD)后,脊髓星形胶质细胞p-PERK、p-eIF2α表达明显增强,给予氧葡萄糖血清再恢复(restoration)后,p-PERK、p-eIF2α表达进一步增强,并在氧葡萄糖血清再恢复(restoration)15分钟后达到峰值。与此同时在OGSD/R前后,PERK、eIF2α表达无明显变化。ATF4在正常未处理的脊髓星形胶质细胞中表达亦很低,给予OGSD/R后,表达逐步增加。 结论:氧葡萄糖血清剥脱/再恢复能够诱导脊髓来源的星形胶质细胞的凋亡。并发现PERK/eIF2α/ATF4通路及caspase-12在此过程中活化。表明内质网应激可能参与氧葡萄糖血清剥脱/再恢复诱导脊髓来源的星形胶质细胞的凋亡。 第三部分 依达拉奉对氧葡萄糖血清剥脱/再恢复所致脊髓星形胶质细胞损伤的保护作用 目的:研究依达拉奉对氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(oxygen-glucose-serum deprivation/restoration, OGSD/R)诱导脊髓来源的星形胶质细胞损伤的保护作用及相关机制。 方法:原代培养大鼠脊髓来源的星形胶质细胞,并采用免疫细胞化学的方法行鉴定。应用CCK8检测试剂盒检测细胞活性和Hoechst 33342荧光染色检测细胞的凋亡;应用DCFH-DA荧光探针检测试剂盒检测细胞ROS水平;应用免疫细胞化学的方法检测caspase-12等内质网应激相关蛋白表达的定性和定位;应用Western-blotting法检测caspase-3、caspase-12、CHOP/GADD153的水平变化及活化情况。 结果:1)氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(OGSD/R)诱导脊髓星形胶质细胞的凋亡;预先给予Eda可以抑制氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(OGSD/R)所致星形胶质细胞凋亡,促进星形胶质细胞的存活。2)以DCFH-DA荧光探针检测Eda对OGSD/R诱导的星形胶质细胞胞内ROS生成变化的影响。氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(OGSD/R)明显增加星形胶质细胞内ROS的水平,预先给予100μM Eda预处理部分抑制OGSD/R诱导的胶质细胞内ROS水平的增高。3)氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(OGSD/R)诱导脊髓星形胶质细胞cleaved- caspase-3表达明显增加,而给予Eda100μM预处理显著减少caspase-3的剪切活化,使cleaved-caspase-3表达减少。4)我们首先采用免疫荧光双标的方法观察在给予氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(OGSD/R)前后caspase-12在脊髓星形胶质细胞中变化。在给予氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(OGSD/R)后,脊髓星形胶质细胞胞浆区caspase-12表达明显增强,而给予100μM Eda预处能后caspase-12表达明显降低。Western blot的方法半定量分析cleaved-caspase12的表达,给予100μM Eda预处能部分抑制OGSD/R诱导的胶质细胞内cleaved-caspase12水平的增高。5)在给予氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(OGSD 8h /R 6h)CHOP/GADD153蛋白表达量明显升高。而预先给予100μM Eda预处可一定程度减少OGSD/R诱导的星形胶质细CHOP/GADD153蛋白的表达。 结论:Eda通过抑制ROS生成、减少内质网应激通路的活化,氧葡萄糖血清剥脱/再恢复(OGSD/R)诱导脊髓星形胶质细胞的凋亡。


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