肾癌特异启动子G250调控的条件增殖腺病毒介导RNA干扰靶向治疗肾癌研究

【摘要】：目的构建G250启动子调控表达Ki67-siRNA的条件增殖型腺病毒G250-Ki67，体外实验研究该CRAd靶向抑制肾癌细胞的疗效，为其体内实验及临床应用提供实验基础。 方法腺病毒左臂质粒pG250-Ki67、pG250–EGFP及腺病毒右臂质粒pBHGE3大量制备及酶切鉴定。将鉴定正确的质粒分别与含有腺病毒的右臂质粒pBHGE3共转染低代293细胞，9～12d后出现病毒空斑，挑取空斑进行重组腺病毒小量扩增，后提取基因组DNA，PCR鉴定，正确者分别命名为G250-Ki67、G250-EGFP。G250-Ki67、G250-EGFP及实验室前期构建的增殖缺陷型腺病毒Ad-Ki67大规模转染低代293细胞，扩增后纯化，并测定滴度。G250-Ki67、G250-EGFP、Ad-Ki67分别转染肾癌786-0细胞（G250阳性表达，G250+）、ACHN细胞（G250阴性表达，G250－）及正常肾小管上皮HK-2细胞。Western Blot法及免疫组化法检测腺病毒E1A蛋白在肾癌细胞中的表达。结晶紫染色法检测腺病毒对肾癌细胞的细胞毒作用。RT-PCR法检测腺病毒对肾癌细胞Ki67基因的沉默效果。MTT法检测腺病毒对肾癌细胞增殖的影响。Annexin V-PE/7-AAD法检测腺病毒对肾癌细胞凋亡的影响。 结果1.酶切鉴定左臂质粒pG250-Ki67、pG250-EGFP及右臂质粒pBHGE3正确。PCR鉴定表明重组腺病毒G250-Ki67及G250-EGFP包含目的基因，且无野生型腺病毒污染。G250-Ki67、G250-EGFP及Ad-Ki67病毒的滴度分别为：2.3×1011PFU/ml、2.11×1011PFU/ml、1.97×1011PFU/ml。 2.腺病毒G250-Ki67、G250-EGFP在肾癌786-0（G250+）细胞中均表达E1A蛋白；在肾癌ACHN（G250－）细胞中，荷载G250启动子腺病毒均不表达E1A。在正常肾小管HK-2细胞中均未检测到E1A的表达； Ad-Ki67感染的786-0、ACHN细胞没有EIA的表达。 3.G250-Ki67抑制肾癌细胞Ki67表达能力明显高于Ad-Ki67，且特异性比Ad-Ki67更高（P＜0.05）。 4.三种病毒对786-O、ACHN细胞均有杀伤作用，MOI=1的G250-Ki67可以将肾癌786-0细胞部分杀灭，MOI=10时全部杀灭。MOI=100的G250-Ki67可以将肾癌ACHN细胞部分杀灭，G250-EGFP对肾癌ACHN细胞无明显杀伤作用。MOI=100时三种病毒对正常肾小管HK-2细胞均无杀伤作用。Ad-Ki67杀伤作用最弱，Ad-Ki67在MOI=10时对786-O、ACHN细胞无影响。 5.G250-Ki67、G250-EGFP、Ad-Ki67对肾癌786-0细胞增殖均有抑制作用，并且存在浓度及时间依赖性，当MOI=0.1时，抑制作用较弱，随着浓度增高，抑制作用逐渐增强，MOI=100时抑制作用最强。MOI=10时，随着天数增加，抑制逐渐增强，第四天抑制作用最强。Ad-Ki67对肾癌ACHN细胞增殖有抑制作用，G250-Ki67、G250-EGFP对肾癌ACHN细胞增殖无明显抑制作用。 6. AnnexinV-PE/7-AAD法检测细胞凋亡，在肾癌786-0细胞中，与其它组比较，G250-Ki67对肾癌786-0细胞凋亡诱导能力最强（P＜0.05）。在肾癌ACHN细胞中，荷载G250启动子腺病毒诱导ACHN细胞凋亡的作用较弱。各组病毒诱导正常HK-2细胞凋亡的作用较弱且组无明显差异（P＞0.05）。 结论成功构建G250-Ki67，其在肾癌细胞内大量扩增且高效表达Ki67-siRNA、抑制肾癌细胞增殖、诱导肾癌细胞凋亡，为肾癌靶向治疗奠定了基础。 目的研究G250启动子调控的荷载Ki67小干扰RNA的条件增殖腺病毒（G250-Ki67）对人肾癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响，为临床肾癌的病毒-基因联合治疗提供依据。 方法将培养至对数生长期的786-0细胞注射裸鼠皮下，构建裸鼠皮下移植瘤模型，建模成功后将裸鼠随机分为4组，每组10只，分别用G250-Ki67病毒、G250-EGFP病毒、Ad-Ki67病毒及PBS进行治疗，病毒每次注射0.2ml（7×108PFU），PBS注射0.2ml，隔天注射一次，共三次。在治疗结束的第7天，每组随机脱颈处死4只动物，取下瘤体组织，免疫组化法检测瘤体内Ki67蛋白及E1A蛋白的表达，Western检测E1A，HE染色观察肿瘤细胞生长情况，TUNEL法检测组织细胞凋亡，其余动物继续饲养，定期测量肿瘤体积，绘制肿瘤时间-体积生长抑制曲线，在治疗的第35天时处死全部动物，测量最终体积，取下肝脏组织，HE染色观察病毒治疗的毒性作用。 结果成功构建人肾透明细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型。免疫组化结果显示G2505-Ki67组Ki67蛋白的表达明显低于其余各组，抑制Ki67表达作用由强到弱依次为G250-Ki67＞Ad-Ki67＞G250-EGFP＞PBS，G250-Ki67组与其余各组之间比较，差异有统计学意义（P0.05）；Western及免疫组化法显示，病毒复制蛋白E1A在PBS组与Ad-Ki67组无表达，而G250-EGFP组及G250-Ki67组可见蛋白表达阳性信号，提示病毒在这两组肿瘤的瘤体内复制；瘤组织HE染色中PBS组细胞浆染色松散色浅，可见胞核呈双叶或多叶分裂像，提示细胞增殖活跃，而G250-Ki67，G250-EGFP及Ad-Ki67组可见到不同程度的细胞核深染，很少有核分裂像，显示肿瘤组织生长抑制，抑制作用由强到弱依次为G250-Ki67＞G250-EGFP＞Ad-Ki67＞PBS；TUNEL检测各治疗组凋亡率分别为PBS组（3.78±1.64）%，G250-EGFP组（27.25±1.10）%，Ad-Ki67组（31.43±2.57）%，G250-Ki67组（65.32±3.24）%，G250-Ki67组与其余三组之间比较差异有统计学意义（P0.05）；肿瘤生长抑制曲线显示G250-Ki67组与其余组比较，抑制肿瘤生长效果最强；病理HE染色，各处理组肝脏未见明显差异。 结论条件增殖腺病毒G250-Ki67能靶向抑制肿瘤组织增殖、促进其凋亡，可有效抑制人肾癌裸鼠移植瘤Ki67蛋白表达，进而抑制肿瘤的生长，为肾癌的病毒-基因联合治疗的提供实验依据。