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肾癌特异启动子G250调控的条件增殖腺病毒介导RNA干扰靶向治疗肾癌研究

刘俊杰  
【摘要】:目的构建G250启动子调控表达Ki67-siRNA的条件增殖型腺病毒G250-Ki67,体外实验研究该CRAd靶向抑制肾癌细胞的疗效,为其体内实验及临床应用提供实验基础。 方法腺病毒左臂质粒pG250-Ki67、pG250–EGFP及腺病毒右臂质粒pBHGE3大量制备及酶切鉴定。将鉴定正确的质粒分别与含有腺病毒的右臂质粒pBHGE3共转染低代293细胞,9~12d后出现病毒空斑,挑取空斑进行重组腺病毒小量扩增,后提取基因组DNA,PCR鉴定,正确者分别命名为G250-Ki67、G250-EGFP。G250-Ki67、G250-EGFP及实验室前期构建的增殖缺陷型腺病毒Ad-Ki67大规模转染低代293细胞,扩增后纯化,并测定滴度。G250-Ki67、G250-EGFP、Ad-Ki67分别转染肾癌786-0细胞(G250阳性表达,G250+)、ACHN细胞(G250阴性表达,G250-)及正常肾小管上皮HK-2细胞。Western Blot法及免疫组化法检测腺病毒E1A蛋白在肾癌细胞中的表达。结晶紫染色法检测腺病毒对肾癌细胞的细胞毒作用。RT-PCR法检测腺病毒对肾癌细胞Ki67基因的沉默效果。MTT法检测腺病毒对肾癌细胞增殖的影响。Annexin V-PE/7-AAD法检测腺病毒对肾癌细胞凋亡的影响。 结果1.酶切鉴定左臂质粒pG250-Ki67、pG250-EGFP及右臂质粒pBHGE3正确。PCR鉴定表明重组腺病毒G250-Ki67及G250-EGFP包含目的基因,且无野生型腺病毒污染。G250-Ki67、G250-EGFP及Ad-Ki67病毒的滴度分别为:2.3×1011PFU/ml、2.11×1011PFU/ml、1.97×1011PFU/ml。 2.腺病毒G250-Ki67、G250-EGFP在肾癌786-0(G250+)细胞中均表达E1A蛋白;在肾癌ACHN(G250-)细胞中,荷载G250启动子腺病毒均不表达E1A。在正常肾小管HK-2细胞中均未检测到E1A的表达; Ad-Ki67感染的786-0、ACHN细胞没有EIA的表达。 3.G250-Ki67抑制肾癌细胞Ki67表达能力明显高于Ad-Ki67,且特异性比Ad-Ki67更高(P<0.05)。 4.三种病毒对786-O、ACHN细胞均有杀伤作用,MOI=1的G250-Ki67可以将肾癌786-0细胞部分杀灭,MOI=10时全部杀灭。MOI=100的G250-Ki67可以将肾癌ACHN细胞部分杀灭,G250-EGFP对肾癌ACHN细胞无明显杀伤作用。MOI=100时三种病毒对正常肾小管HK-2细胞均无杀伤作用。Ad-Ki67杀伤作用最弱,Ad-Ki67在MOI=10时对786-O、ACHN细胞无影响。 5.G250-Ki67、G250-EGFP、Ad-Ki67对肾癌786-0细胞增殖均有抑制作用,并且存在浓度及时间依赖性,当MOI=0.1时,抑制作用较弱,随着浓度增高,抑制作用逐渐增强,MOI=100时抑制作用最强。MOI=10时,随着天数增加,抑制逐渐增强,第四天抑制作用最强。Ad-Ki67对肾癌ACHN细胞增殖有抑制作用,G250-Ki67、G250-EGFP对肾癌ACHN细胞增殖无明显抑制作用。 6. AnnexinV-PE/7-AAD法检测细胞凋亡,在肾癌786-0细胞中,与其它组比较,G250-Ki67对肾癌786-0细胞凋亡诱导能力最强(P<0.05)。在肾癌ACHN细胞中,荷载G250启动子腺病毒诱导ACHN细胞凋亡的作用较弱。各组病毒诱导正常HK-2细胞凋亡的作用较弱且组无明显差异(P>0.05)。 结论成功构建G250-Ki67,其在肾癌细胞内大量扩增且高效表达Ki67-siRNA、抑制肾癌细胞增殖、诱导肾癌细胞凋亡,为肾癌靶向治疗奠定了基础。 目的研究G250启动子调控的荷载Ki67小干扰RNA的条件增殖腺病毒(G250-Ki67)对人肾癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响,为临床肾癌的病毒-基因联合治疗提供依据。 方法将培养至对数生长期的786-0细胞注射裸鼠皮下,构建裸鼠皮下移植瘤模型,建模成功后将裸鼠随机分为4组,每组10只,分别用G250-Ki67病毒、G250-EGFP病毒、Ad-Ki67病毒及PBS进行治疗,病毒每次注射0.2ml(7×108PFU),PBS注射0.2ml,隔天注射一次,共三次。在治疗结束的第7天,每组随机脱颈处死4只动物,取下瘤体组织,免疫组化法检测瘤体内Ki67蛋白及E1A蛋白的表达,Western检测E1A,HE染色观察肿瘤细胞生长情况,TUNEL法检测组织细胞凋亡,其余动物继续饲养,定期测量肿瘤体积,绘制肿瘤时间-体积生长抑制曲线,在治疗的第35天时处死全部动物,测量最终体积,取下肝脏组织,HE染色观察病毒治疗的毒性作用。 结果成功构建人肾透明细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型。免疫组化结果显示G2505-Ki67组Ki67蛋白的表达明显低于其余各组,抑制Ki67表达作用由强到弱依次为G250-Ki67>Ad-Ki67>G250-EGFP>PBS,G250-Ki67组与其余各组之间比较,差异有统计学意义(P0.05);Western及免疫组化法显示,病毒复制蛋白E1A在PBS组与Ad-Ki67组无表达,而G250-EGFP组及G250-Ki67组可见蛋白表达阳性信号,提示病毒在这两组肿瘤的瘤体内复制;瘤组织HE染色中PBS组细胞浆染色松散色浅,可见胞核呈双叶或多叶分裂像,提示细胞增殖活跃,而G250-Ki67,G250-EGFP及Ad-Ki67组可见到不同程度的细胞核深染,很少有核分裂像,显示肿瘤组织生长抑制,抑制作用由强到弱依次为G250-Ki67>G250-EGFP>Ad-Ki67>PBS;TUNEL检测各治疗组凋亡率分别为PBS组(3.78±1.64)%,G250-EGFP组(27.25±1.10)%,Ad-Ki67组(31.43±2.57)%,G250-Ki67组(65.32±3.24)%,G250-Ki67组与其余三组之间比较差异有统计学意义(P0.05);肿瘤生长抑制曲线显示G250-Ki67组与其余组比较,抑制肿瘤生长效果最强;病理HE染色,各处理组肝脏未见明显差异。 结论条件增殖腺病毒G250-Ki67能靶向抑制肿瘤组织增殖、促进其凋亡,可有效抑制人肾癌裸鼠移植瘤Ki67蛋白表达,进而抑制肿瘤的生长,为肾癌的病毒-基因联合治疗的提供实验依据。


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