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吗啡与氯胺酮对人离体T辅助淋巴细胞分化的影响及机制研究

高梅  
【摘要】:背景:T辅助淋巴(Th)细胞的分化对免疫平衡起着重要作用,我们的前期工作已初步发现一些麻醉性镇痛药物如吗啡、氯胺酮、曲马多等对Th细胞的分化有明显影响。已知吗啡和氯胺酮均是通过其相应受体—μ受体和NMDA受体产生麻醉镇痛作用。Th细胞表面既存在μ受体,又存在NMDA受体。T-bet和GATA3分别是Th细胞向Th1和Th2细胞分化信号传导通路中重要的转录因子。在吗啡与氯胺酮影响Th细胞分化的过程中,这两个转录因子和其比值是如何变化的尚不清楚。 目的:观察比较吗啡与氯胺酮对Th细胞分化的影响、μ受体和NMDA受体的作用及T-bet和GATA3活性及比值的变化,探讨其可能的作用机制。 方法:10名男性健康志愿者(20-45岁,BMI15-25),分别采集空腹时外周静脉血20ml,Ficoll液分离外周血单核细胞(PBMCs)。每份血样的PBMCs均随机加入刺激剂PMA25ng/ml和离子霉素1μg/ml以及相应浓度的干预药物(吗啡、纳络酮、氯胺酮、MK801)在37°C、95%湿度、5%CO2的温箱中孵育4小时。其中吗啡的干预浓度为50ng/ml,纳络酮为25ng/ml和50ng/ml,氯胺酮浓度分别为为40μM、50μM、100μM、200μM,MK801终浓度为100μM。然后采用FACSVantageSE流式细胞仪计数Th细胞亚群百分数,用ELISA检测细胞培养上清液中的IFN-γ和IL-4的水平,用EMSA测量细胞内转录因子T-bet和GATA3与DNA结合活性。实验数据采用SPSS11.0软件的单因素方差分析或Dunnett’s T3检验。 结果: 1.与仅用刺激剂组比较,50ng/ml的吗啡明显降低Th1细胞数量(从16.4±4.6%到8.4±2.0%,P0.001)和Th1/Th2比值(从3.7±1.1到1.5±0.3,P=0.002);使IFN-γ水平(从5644.0±2105.8pg/ml到1631.8±532.7pg/ml,P=0.002)和IFN-γ/IL-4比值(从18.2±7.1到7.8±2.2,P=0.047)显著降低;同时明显降低T-bet的反应活性(从5.4±0.6到4.0±0.3,P0.001)及T-bet/GATA3的比值(从1.6±0.2到1.2±0.1,P=0.001)。50ng/ml的纳络酮能明显消除吗啡对Th细胞向Th1细胞分化的抑制作用(从8.4±2.0%到13.9±3.6%,P0.01)及对Th1/Th2比值的降低作用(从1.7±0.6到2.9±0.5,P0.01);使Th1细胞分泌的细胞因子增多,表现为IFN-γ(从1631.8±532.7pg/ml到4726.0±1105.6pg/ml,P0.01)和IL-4(从183.6±40.1pg/ml到311.6±89.0pg/ml,P0.05)上升及IFN-γ/IL-4比值升高(从8.7±1.4到15.4±1.9,P0.01);同时消除吗啡对T-bet(从4.0±0.3到5.3±0.7,P0.01)反应活性的抑制作用,使T-bet/GATA3比值上升(从1.2±0.1到1.8±0.2,P0.05)。 2.10μg/ml的氯胺酮降低Th1(从16.4±4.6%到13.2±3.2%,P=0.072)和Th2细胞(从5.0±1.5%到2.2±0.7%,P=0.002)数量,但升高Th1/Th2比值(从3.7±1.1到6.4±1.7, P=0.011);明显降低IFN-γ (从5644.0±2105.8pg/ml到1949.1±633.9pg/ml, P=0.004)和IL-4水平(从374.9.3±168.4pg/ml到106.3±40.7pg/ml, P=0.008);在显著降低T-bet(从5.4±0.6到4.6±0.3,P=0.031)和GATA3反应活性(从3.3±0.3到2.2±0.3,P0.001)同时,却明显增加T-be t/GATA3的比值(从1.6±0.2到2.0±0.3,P0.001)。 3.与仅加入刺激剂组相比,100μM浓度的MK801,能降低Th1(从17.1±2.7%到13.2±3.2%,P=0.008)和Th2(从5.0±1.6%到2.2±0.7%,P0.001)细胞数量,但显著升高Th1/Th2比值(从3.7±1.3至6.4±1.7,P=0.001);降低IFN-γ(从5645.0±2105.1至1949.1±633.9pg/ml, P=0.004)和IL-4(从92.3±27.3至19.9±7.0pg/ml,P0.001)水平,有增加IFN-γ/IL-4比值的趋势(从63.5±23.2至106.7±40.9,P=0.133);MK801明显抑制T-be(t从5.4±0.6降至4.6±0.3,P=0.031)和GATA3(从3.4±0.3降至2.2±0.3,P0.001)的活性,但使T-bet/GATA3的比值显著增高(从1.6±0.2升至2.1±0.3,P=0.003)。 4.与仅加入刺激剂组相比,氯胺酮呈剂量依赖性的降低Th1细胞(从17.1±2.7%到14.1±2.4%、P=0.22,3.1±3.3%、P=0.003和11.6±2.7%、P0.001)和Th2细胞(从5.0±1.6%到3.6±1.0%、P=0.151,2.4±0.8%、P=0.002和2.2±0.3%、P=0.002)的数量,但增加Th1/Th2比值(从3.7±1.3到4.3±1.9、P=0.389,5.9±1.8、P=0.003和5.3±1.2、P=0.029);而IFN-γ(从5645.0±2105.1pg/ml到3174.0±1179.6pg/ml、P=0.073,1631.8±532.7pg/ml、P=0.002和1015.3±168.9pg/ml、P=0.001)和IL-4(从92.3±27.3pg/ml到41.9±13.7pg/ml、P=0.002,20.4±7.9pg/ml、P0.001和10.4±3.1pg/ml、P0.001)水平也随氯胺酮浓度升高而逐渐降低;T-be(t从5.4±0.6到4.4±0.5、P0.001,4.0±0.3、P0.001和3.4±0.3、P0.001)和GATA3的活性(从3.4±0.3到2.3±0.2、P0.001,2.1±0.3、P0.001以及1.7±0.2、P0.001)均逐渐降低;但IFN-γ/IL-4比值(从63.5±23.2到77.4±22.9、P=0.927,90.3±39.2、P=0.635和106.8±41.6、P=0.142)和T-bet/GATA3活性比值(从1.6±0.2到1.9±0.4、P=0.054,2.0±0.4、P=0.018和2.0±0.3、P=0.008)则均呈上升趋势。 结论:在PMA和离子霉素的刺激下,吗啡抑制人离体Th细胞向Th1和Th2分化,抑制IFN-γ和IL-4的分泌,降低Th1/Th2、 IFN-γ/IL-4及T-bet/GATA3比值,这一结果提示吗啡抑制Th1细胞作用甚于Th2细胞。氯胺酮在剂量依赖性降低Th细胞向Th1和Th2分化数值同时,增加Th1/Th2、IFN-γ/IL-4和T-be t/GATA3比值,提示其抑制Th2细胞甚于Th1细胞。纳络酮能消除吗啡对Th细胞分化的抑制作用,提示吗啡对Th细胞分化的影响与μ受体作用有关;MK801对Th细胞分化的影响与氯胺酮类似,提示氯胺酮对Th细胞分化的影响与NMDA受体相关。两药对T-bet/GATA3比值的影响明显不同。


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