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端粒酶基因多态与儿童急性淋巴细胞白血病易感性的分子流行病学研究

盛晓静  
【摘要】:急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)是儿童最常见的肿瘤,约占儿童肿瘤的1/3。美国“监测、流行病学和最终结果”(surveillence,epidemiology, and end results, SEER)显示每年大约有3,250儿童诊断为白血病,中国每年新增ALL儿童12,000人,ALL成为威胁全球儿童健康的重要疾病之一。如何识别ALL的高危人群,降低儿童ALL的发病率,是摆在我们面前的重要问题。儿童ALL的具体病因目前尚不完全清楚,发病机制也十分复杂。流行病学、分子生物学和遗传学的研究证实,儿童ALL是环境因素和遗传因素共同作用的疾病。宏观流行病学研究表明,个体因素(如免疫系统缺陷性疾病)和环境暴露因素(如家庭装修、母亲孕期感染、长期接触放射环境)是ALL发病的危险因素。但不同遗传背景的个体在相同的环境危险因素暴露下发生ALL的危险性不同,说明遗传背景的差异影响了个体癌症易感性的高低。因此,识别ALL的易感基因是鉴别ALL高危人群的关键。 目前已知,染色体和基因重排是白血病的重要遗传学标志。染色体的末端异常是导致基因重排的重要原因并参与了白血病的发病。端粒位于染色体的末端,由DNA重复序列和蛋白组成,产生一个称为端粒体的特殊结构来保护染色体末端防止融合和降解。端粒包括端粒酶和端粒相关蛋白(shelterin)。端粒酶以自身RNA(TERC)为模板,在端粒酶反转录酶(TERT)的作用下,在染色体末端合成端粒TTAGGG重复序列,维持端粒长度的稳定。端粒酶活性在大多数体细胞中是缺失的,但在90%人类肿瘤中可以检测到端粒酶过表达。端粒酶的异常表达导致细胞生命的延长和永生,从而导致癌变,并且在肿瘤形成过程中,端粒酶还参与DNA损伤修复、染色质结构调节和基因表达调控。目前研究发现,对于大约10%~15%不表达TERT或端粒酶的细胞,选择性地延长端粒(alternative lengthening of telomeres, ALT)通路是维持端粒长度的机制,且为正常细胞死亡逃逸和恶性转化的机制。最新的meta分析发现,缩短的端粒与多种肿瘤的发病风险有关,并且成人ALL患者的端粒长度比正常骨髓细胞短,伴随着端粒酶活性的增高。因此,端粒酶的遗传变异与儿童ALL的发生发展可能存在很大的关联,但是目前尚未见相关研究报道。 人类基因组计划(Human Genome Project, HGP)研究表明,基因组中的遗传变异会影响基因的结构和功能,而单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism, SNP)是遗传变异中最常见的一种类型。目前有多个全基因组关联研究(gemome-wide association study, GWAS)结果发现TERT基因内部多个SNPs与多种肿瘤易感性有关、TERC基因附近SNPs与端粒长度有关。 近年来儿童ALL遗传药理学的研究成为热点,而单核苷酸多态性是遗传药理学所研究的重要的遗传变异。大剂量甲氨喋呤(high dose methotrexate,HDMTX)联合亚叶酸钙(calcium folinate, CF)是儿童ALL常见的治疗方法,成为儿童ALL遗传药理学研究的经典模型。端粒酶已被证实为影响药物代谢的候选基因。 本研究旨在通过宏观流行病学和分子流行病学相结合的手段,采用病例-对照的研究方法,评价端粒酶主要组成基因(TERT和TERC基因)多态变异及端粒长度与儿童ALL发生风险间的关系,并在此基础上分析两基因多态变异与端粒长度及大剂量甲氨喋呤代谢敏感性之间的关系,该研究结果为进一步揭示儿童ALL发病机制提供重要的理论依据,并为筛选与中国人群ALL发生风险相关的易感性生物标志物以用于今后筛查高危人群或易感个体,实施目标明确的个体化预防、干预和临床治疗等方面提供新的策略和思路。 第一部分 TERT基因多态与儿童急性淋巴细胞白血病易感性的分子流行病学研究 TERT在维持端粒长度、染色体稳定和细胞凋亡/死亡等方面起到重要作用。有研究表明白血病患者端粒长度缩短,端粒酶活性增高,因此TERT基因遗传变异可能与儿童ALL的发生发展有关。 本部分研究对象包括570例经骨髓涂片、免疫分型确诊的儿童ALL病例和673例在年龄和性别上与病例匹配的对照。采用标签SNPs的选点策略,筛选出11个标签SNPs以覆盖整个TERT基因(包括上下游各2,000bp),探讨TERT遗传变异与儿童ALL发病风险的关系。 单个SNP位点Logistic回归结果显示,TERT启动子区rs2736109和rs2735940,内含子区(rs2736100、rs2853676、rs10069690和rs4246742)与儿童ALL的发病风险有关。在联合分析中,我们发现携带6~11个危险等位基因的个体比携带0~5个危险等位基因的个体更易罹患ALL(调整OR=1.44,95%CI=1.13-1.84),并且这种风险在B-ALL中更明显。值得注意的是,TERT第2内含子的两个SNPs与端粒长度有关,即rs2736100CC基因型比野生基因型增加61%的机会获得长端粒,rs2853676AG/AA基因型比野生基因型增加27%的机会获得长端粒。但未发现这些标签SNPs与TERT mRNA表达水平和端粒酶活性的关系。 上述结果显示,TERT遗传变异与儿童ALL的易感性有关,可能影响了端粒长度的自身平衡,从而参与了ALL的发病。 第二部分 TERC基因多态与儿童急性淋巴细胞白血病易感性的分子流行病学研究 端粒在维持染色体稳定、细胞凋亡/死亡和肿瘤发生中起到重要作用。端粒长度缩短和/或端粒功能障碍是肿瘤形成的重要原因。端粒的延长依赖于TERC编码的自身RNA模板,在TERT编码的逆转录酶的作用下进行。最近的GWAS发现包含TERC的3q26的两个SNPs位点(rs12696304和rs16847897)与端粒长度有关。因此,TERC的遗传变异可能与儿童ALL的发生发展有关。本部分研究对象包括570例儿童ALL病例和673例在年龄和性别上与病例匹配的对照。对这两个点采用TaqMan基因分型法,探讨TERC遗传变异与儿童ALL发病风险的关系。结果发现与野生CC基因型相比,携带rs16847897CG基因型的儿童罹患ALL的风险明显增加(调整OR=1.29,95%CI=1.00-1.67),而rs12696304多态变异与儿童ALL的发病风险无关。结果还发现,这两个SNPs位点与端粒长度无关。上述结果表明,TERC基因与中国汉族儿童ALL发病风险升高有关,其中rs16847897CG杂合子可能为危险基因型。 第三部分端粒长度与儿童急性淋巴细胞白血病易感性的关联研究 端粒长度具有遗传特性,不同的个体、不同的细胞、不同的组织间均存在差异。端粒长度的缩短在肿瘤的发生和发展中起到重要作用。多项流行病学研究发现,缩短的端粒长度与多种肿瘤的发生风险有关,但目前未见有关中国汉族儿童ALL与端粒长度的研究报道。本研究针对570例儿童ALL病例和673例健康对照,采用T/S相对定量PCR法进行相对端粒长度的检测,并进行了相关危险因素的流行病学研究。结果发现,与最短的端粒长度组(1分组)相比,适中的端粒长度(2分组和3分组)与ALL发病风险降低有关,表现为保护作用,调整的OR值和95%可信区间分别为0.65(0.47-0.91)和0.56(0.40-0.79)。该研究结果提示,极端的端粒长度可能是影响儿童ALL发病风险的重要生物标志物。 第四部分 端粒酶基因多态与大剂量甲氨蝶呤排泄延迟的关联研究 大剂量甲氨蝶呤联合亚叶酸钙解救是目前预防儿童ALL髓外白血病和全身巩固治疗的有效措施,但治疗时若发生排泄延迟,常发生严重的毒副作用(如口腔黏膜、肝肾功能损害等),且个体间存在较大差异。端粒酶基因多态可能通过影响MTX药物凋亡通路而与MTX代谢敏感性存在关联。 本部分研究对象为123名接受HDMTX治疗的ALL患儿,进行HDMTX治疗开始后44h和68h时间点的MTX代谢及肝脏毒性与端粒酶主要基因(TERT和TERC)多态变异的研究。 研究发现,123例接受大剂量MTX治疗的患儿,44h监测点MTX血清平均浓度为0.73±0.84μmol/L,68h为0.21±0.27μmol/L,一共有69例(56.1%)发生了MTX排泄延迟,41例(33.3%)发生肝功能损伤,其中有18例(14.6%)MTX排泄延迟的患儿发生了肝功能损伤。位于TERT启动子区的rs2735940CT/TT基因型个体发生HDMTX44h排泄延迟的机率比携带CC基因型个体增加1.89倍(OR=2.89,95%CI=1.08-7.77),而位于TERT第2内含子的rs2736100AC/CC基因型个体发生HDMTX44h排泄延迟的机率比携带AA基因型个体增加1.64倍(OR=2.64,95%CI=1.01-6.87),但是这两个SNPs与68h MTX排泄延迟没有关联,亦与肝功能损伤无关联。 上述结果提示TERT基因多态与HDMTX治疗后44h血药浓度及排泄延迟之间存在关联,这为MTX的遗传药理学研究提供参考,为儿童ALL的临床个体化治疗提供新的理论依据。


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