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sFlt-1和低氧介导的内皮功能降低及氧化应激恶性循环在子痫前期滋养细胞凋亡机制中的研究

姜子燕  
【摘要】:子痫前期是妊娠特有多系统受累的疾病,主要临床表现为妊娠20周后出现高血压(≥140/90mmHg)和蛋白尿(≥0.3g/24h)。临床只能采取解痉、降压、终止妊娠等对症治疗措施,疗效及预后不理想,所以目前仍然是导致孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一。迄今为止,子痫前期发病机理未完全清楚,其中最被广泛认可和接受的是子宫螺旋动脉重铸障碍,包括异常滋养细胞侵入子宫肌层及其介导的血管平滑肌细胞和内皮细胞凋亡,可引起母体内皮功能降低和胎盘氧化应激损伤,最终引起胎盘主要功能细胞—滋养细胞出现过度凋亡反应。本研究认为内皮功能降低和氧化应激损伤两者之间存在密切联系,而联系这两者的是sFlt-1和低氧两大因子,二者构成恶性循环,共同作用导致子痫前期发生。因此本研究从三个方面验证这一恶性循环在子痫前期中的作用机制:1.在孕妇血浆标本及动物整体水平验证sFlt-1是否与子痫前期发生密切相关;2.通过sFlt-1干预脐静脉内皮细胞HUVEC实验、滋养细胞HTR-8/SVneo缺氧实验及过表达sFlt-1的HTR-8/SVneo细胞与HUVEC细胞共培养实验,验证恶性循环假设;3.在HTR-8/SVneo细胞及人胎盘组织水平研究恶性循环对滋养细胞凋亡的影响。 第一部分:sFlt-1与子痫前期发生密切相关 目的:在孕妇血浆标本及动物整体水平验证sFlt-1是否与子痫前期发生密切相关。 方法:1.江苏省人民医院妇产科住院分娩的子痫前期(n=32)和正常孕妇(n=35)。子痫前期分为早发组(preterm preeclampsia,PP,34周,平均孕龄33.2±0.4周,n=14)和晚发组(term preeclampsia,TP,≥34周,平均孕龄36.2±0.2周,n=18)。为匹配相应孕周,正常组也分为早发对照组(preterm normalpregnancy,PNP,34周,平均孕龄33.7±0.9周, n=17)和晚发对照组组(term normal pregnancy,TNP,≥34周,孕37.8±0.3周,n=18)。通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测两组(PP vs. PNP; TP vs. TNP)孕妇血浆中sFlt-1表达水平。2.通过对ICR小鼠于妊娠第8天开始连续8天腹腔注射sFlt-1或生理盐水。检测孕鼠血压及尿蛋白,ELISA法检测两组孕鼠血浆中sFlt-1水平,RT-PCR检测孕鼠胎盘sFlt-1mRNA表达,HE染色观察两组胎盘、子宫、肾脏形态学变化,电镜观察肾脏及胎盘超微结构变化。 结果:1.比较分为两组:子痫前期早发组vs.正常早发对照组(PP vs.PNP),子痫前期晚发组vs.正常晚发对照组(TP vs.TNP)。两对比较组间,年龄、BMI、孕周、吸烟等临床指标均无显著性差异,收缩压、舒张压、蛋白尿及胎儿出生体重均具有显著差异。2.血浆中sFlt-1水平(PP vs.PNP,45.07±22.32ng/mLvs.14.59±2.64ng/mL,p 0.01)。子痫前期孕妇血浆中sFlt-1水平明显高于正常对照组。3. sFlt-1干预的孕鼠胎盘组织中sFlt-1mRNA水平明显高于生理盐水处理组,孕鼠血浆中sFlt-1水平(2.5±0.13ng/mL)也明显高于生理盐水处理组(0.9±0.03ng/mL),差异具有统计学意义(p 0.05),结果显示sFlt-1干预孕鼠效果显著。4. sFlt-1处理组血压、蛋白尿均明显高于生理盐水组(p 0.05),胎鼠数量和出生体重均未出现明显差异(p0.05)。5.与生理盐水处理组相比,sFlt-1处理组孕鼠胎盘血管内皮损伤,胎盘滋养细胞出现氧化应激改变;子宫内膜血管变少、变薄;肾小球血管裂隙形成、内皮细胞基底膜增厚、足突融合等改变。 结论:通过临床血浆标本和孕鼠干预实验证实sFlt-1与子痫前期发生发展密切相关。 第二部分:sFlt-1和低氧是介导子痫前期内皮功能降低 及氧化应激恶性循环过程中的重要因子目的:sFlt-1和低氧是否是介导内皮功能降低及氧化应激恶性循环过程中的重要因子。 方法:1.sFlt-1干预脐静脉内皮细胞(HUVEC)48h,通过血管形成实验观察sFlt-1对血管生成的影响,Western blot检测HUVEC细胞一氧化氮合酶(eNOS)表达量;2.对滋养细胞HTR-8/SVneo行1%缺氧处理48h,ELISA法检测细胞sFlt-1分泌量及培养基中氧化应激指标丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)表达量;3.将过表达sFlt-1的HTR-8/SVneo与HUVEC共培养48h,通过血管形成实验观察sFlt-1对HUVEC血管生成的影响,Western blot检测细胞eNOS表达量。 结果:1.sFlt-1处理的HUVEC血管长度及节点数明显低于对照组,sFlt-1处理组HUVEC细胞eNOS表达量明显降低。2.缺氧条件下HTR-8/SVneo分泌sFlt-1量明显增加,sFlt-1mRNA表达量明显增加,培养基中MDA水平明显增加,SOD活力明显降低。3.与sFlt-1过表达的HTR-8/SVneo共培养后,HUVEC细胞管型形成能力明显降低,eNOS蛋白表达量显著降低。 结论:sFlt-1和低氧是介导内皮功能降低及氧化应激恶性循环过程中的重要因子。 第三部分:sFlt-1和低氧促进子痫前期滋养细胞凋亡作用 目的:sFlt-1和低氧是否促进子痫前期滋养细胞凋亡作用。 方法:1.对滋养细胞HTR-8/SVneo行sFlt-1和/或缺氧处理48h,流式细胞技术检测细胞调亡,Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Caspase-3表达。2.对正常胎盘绒毛组织行sFlt-1和/或缺氧处理48h,Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Caspase-3表达。3.Western blot方法检测正常和子痫前期胎盘组织中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Caspase-3表达量。 结果:1.三组处理组细胞凋亡率均明显增加,在sFlt-1与缺氧两种因素共同存在时,细胞凋亡率增加最明显,增加到13%;三组处理组细胞促凋亡蛋白Bax明显上调,抑凋亡蛋白Bcl-2明显下调,凋亡执行蛋白Caspase-3表达上调,在sFlt-1与缺氧两种因素共同存在时,相关蛋白表达上调变化最为明显。2.三组处理组细胞促凋亡蛋白Bax明显上调,抑凋亡蛋白Bcl-2明显下调,凋亡执行蛋白Caspase-3表达上调,在sFlt-1与缺氧两种因素共同存在时,凋亡相关蛋白表达变化最为明显。3.子痫前期组与正常对照组比较(PP vs.PNP,TP vs.TNP),两组比较结果显示:无论是早发还是晚发,子痫前期组胎盘组织促凋亡蛋白Bax、凋亡执行蛋白Caspase-3均明显表达上调,而抑凋亡蛋白Bcl-2均明显表达下调。结论:sFlt-1和低氧促进子痫前期滋养细胞凋亡作用。


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