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1,25(OH)_2D缺乏在颞下颌关节骨关节病发生中的作用及机制研究

沈铭  
【摘要】:近年来研究结果显示,活性维生素D[1,25(OH)2D]不仅与钙、磷代谢密切相关,且其缺乏也与很多年龄依赖的慢性疾病有着密切关联,如骨质疏松、癌症、高血压、心血管疾病、糖尿病和神经退行性病变等。流行病学调查显示维生素D缺乏的妇女白细胞端粒长度变短,与寿命减短相关。这些结果提示维生素D在衰老过程中起有重要的作用。此外,还有流行病学调查结果显示,血清中25-羟化维生素D(25-OHD)的水平与骨关节病的发生、发展相关。但是活性维生素D缺乏在骨关节病发生中的作用目前研究较少,其中可能的机制尚不清楚。骨关节病(osteoarthritis,OA)是一种常见的、进行性发展的非感染性衰老相关疾病,常罹患单个关节,是最常见的关节炎形式和引起慢性残疾的首要因素。OA可累及关节所有组织,最终使关节相关组织内细胞和基质在形态、结构、生化、分子及生物力学上均发生改变。OA的特点是关节软骨细胞间质成分的进行性退变,伴随继发性炎症因子的产生。位于口腔颌面部的颞下颌关节OA的临床表现除了典型的OA症状,如:关节疼痛、压痛、活动受限、嘎轧响声,偶尔有渗出及不同程度局部炎症外,其还严重影响了患者的咀嚼及语言功能的发挥。为了探讨1,25(OH)2D在OA发生发展中的作用及可能的机制,本研究利用1,25(OH)2D缺乏的25-羟化维生素D 1α羟化酶基因敲除[1α(OH)ase-/-]小鼠模型。通过给予高钙高磷饮食(含2%钙、1.25%磷和20%乳糖)同窝野生型小鼠及1α(OH)ase-/-小鼠,于18m处死,利用影像学、组织化学、免疫组织化学和相关生化指标检测等方法观察1,25(OH)2D缺乏对小鼠颞下颌关节的影响。进一步通过正常饮食(含1%钙、0.67%磷)或高钙高磷饮食及高钙高磷饮食同时给予N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)喂养或皮下注射1,25(OH)2D的1α(OH)ase-/-小鼠,并于10周龄或6月龄处死,与正常饮食的同窝野生型小鼠比较。利用影像学、组织化学、免疫组织化学、Western-blot和相关生化指标检测等方法比较分析了这些小鼠颞下颌关节的表型差异。以明确1,25(OH)2D缺乏在颞下颌关节OA发生、发展中的作用机制。第一部分1,25(OH)2D缺乏对老龄鼠颞下颌关节的影响近年来有流行病学研究结果表明,血清中25-OHD的水平与骨关节病的发生、发展相关,但其中可能的作用机制仍不清楚。颞下颌关节OA作为OA一种重要类型,其同样具有OA所有的主要病理特点,且由于其早期发病隐匿,临床上现有的各种治疗方法效果有限,严重影响了患者的生活质量。为了明确1,25(OH)2D缺乏与骨骼的衰老相关性疾病——颞下颌关节OA的关系,本研究利用1,25(OH)2D缺乏的1α(OH)ase-/-小鼠模型,通过3周断奶后给予高钙高磷饮食(含2%钙、1.25%磷和20%乳糖)同窝野生型小鼠及1α(OH)ase-/-小鼠,于18m龄处死,利用影像学、组织化学、免疫组织化学和相关生化指标检测等方法观察同窝野生型小鼠及1α(OH)ase-/-小鼠颞下颌关节表型的差别。结果表明:(1)在断奶后给予1α(OH)ase-/-小鼠高钙高磷饮食后,其血清钙、磷水平均恢复正常,仅存在血清1,25(OH)2D水平的明显降低;而同窝野生型小鼠在给予高钙高磷饮食后,其血清钙、磷及1,25(OH)2D水平均在正常范围内。(2)18月龄1α(OH)ase-/-小鼠的髁状突表面较同窝野生型出现了较明显的塌陷,软骨厚度明显变薄,软骨基质中糖胺聚糖及Ⅱ型胶原含量减少,纤维成分增多,呈现典型的OA病理表型。(3)18月龄1α(OH)ase-/-小鼠较同窝野生小鼠型其软骨及软骨下骨内氧化应激导致DNA损伤相关指标及细胞衰老指标明显增高。(4)18月龄1α(OH)ase-/-小鼠的髁状突软骨细胞较同窝野生型分泌更多的衰老相关分泌表型相关炎症因子,同时也是较主要的OA相关炎症因子,包括:白细胞介素(interleukin,IL)1α,IL-1β及IL-6,基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)3,MMP-13。本部分研究结果提示,1,25(OH)2D的缺乏可能通过增加颞下颌关节软骨及软骨下骨细胞的DNA损伤,加速衰老进程继而产生衰老相关分泌表型,其所产生的炎症因子导致了颞下颌关节OA发生、发展。第二部分1,25(OH)2D缺乏对小鼠颞下颌关节发育的影响基于第一部分的研究结果,为了进一步明确1,25(OH)2D的缺乏对小鼠颞下颌关节的影响,明确氧化应激在其中可能的作用机制,本部分实验通过断奶后给予1α(OH)ase-/-小鼠正常饮食、高钙高磷饮食、高钙高磷饮食及NAC水(1g/L)、皮下注射1,25(OH)2D(1ug/kg,qod),观察这四组小鼠10周龄与正常饮食同窝野生型小鼠颞下颌关节的表型差异,通过影像学、组织化学、免疫组织化学和相关生化指标检测等方法以明确氧化应激在1,25(OH)2D缺乏导致小鼠颞下颌关节发育异常中的作用。本部分结果表明:(1)影像学检查,给予高钙高磷饮食后能明显改善1α(OH)ase-/-小鼠软骨下骨的矿化异常,但骨密度较野生型小鼠相比仍较低。给予高钙高磷饮食及NAC水后,其软骨下骨的骨密度有进一步的改善,但仍未达到野生型小鼠的水平。皮下注射1,25(OH)2D的1α(OH)ase-/-小鼠其软骨下骨的骨密度较野生型小鼠无明显差异。(2)碱性磷酸酶(ALP)组织化学染色的结果进一步显示,1α(OH)ase-/-小鼠软骨下骨ALP含量较野生型小鼠明显增高,这与其继发性的高PTH血症有关。在给予高钙高磷饮食后其ALP含量明显低于野生型小鼠,这与继发性高PTH血症得以纠正相关。在给与高钙高磷饮食与NAC水后,其ALP含量较单纯给予高钙高磷饮食明显增加。皮下注射1,25(OH)2D的1α(OH)ase-/-小鼠其软骨下骨ALP含量较野生型小鼠无明显差异。(3)Ⅱ型胶原免疫组织化学染色显示,1α(OH)ase-/-小鼠软骨基质内Ⅱ型胶原含量较野生型小鼠明显减少。在给予高钙高磷饮食后,其软骨基质内Ⅱ型胶原含量有一定程度的增加,而给予高钙高磷饮食及NAC水后,其软骨基质内Ⅱ型胶原含量进一步增加,但仍低于野生型小鼠。皮下注射1,25(OH)2D的1α(OH)ase-/-小鼠其软骨基质内Ⅱ型胶原含量较野生型小鼠无明显差异。(4)1α(OH)ase-/-小鼠软骨下骨破骨细胞数较给予高钙高磷饮食小鼠明显增高,但其均为无活性的破骨细胞;在给与NAC水后,其破骨细胞数量较单纯给予高钙高磷饮食明显增加。皮下注射1,25(OH)2D的1α(OH)ase-/-小鼠其软骨下骨内破骨细胞数量较野生型小鼠无明显差异。为了进一步证实1,25(OH)2D缺乏导致的小鼠颞下颌关节发育异常是否与氧化应激水平增加有关,我们检测了颞下颌关节组织中过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量,总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。1α(OH)ase-/-小鼠颞下颌关节组织内H2O2及MDA含量明显增高,而T-SOD活性和GSH-Px活性均明显下降,显示抗氧化能力显著下降,发生明显的氧化损伤。在给予高钙高磷饮食后,H2O2及MDA含量较正常饮食组明显减少,而T-SOD活性和GSH-Px活性无明显增加。再进一步给予NAC水后,H2O2及MDA含量较仅给予高钙高磷饮食组进一步减少,而T-SOD活性和GSH-Px活性仍无明显增加。皮下注射1,25(OH)2D的1α(OH)ase-/-小鼠其H2O2和MDA含量,T-SOD和GSH-Px活性较野生型小鼠无明显差异。本部分研究结果提示,1,25(OH)2D的缺乏导致的小鼠颞下颌关节发育异常可能与氧化应激水平增加有关。第三部分氧化应激在1,25(OH)2D缺乏导致的颞下颌关节骨关节病中的作用机制基于前两部分的研究结果,表明氧化应激在1,25(OH)2D缺乏导致的小鼠颞下颌关节相关病变中发挥重要作用。为了进一步明确氧化应激在1,25(OH)2D缺乏导致的小鼠颞下颌关节骨关节病发生中相关的作用机制,本部分实验通过断奶后给予1α(OH)ase-/-小鼠正常饮食、高钙高磷饮食、高钙高磷饮食及NAC水(1g/L)、皮下注射1,25(OH)2D(1ug/kg,qod),观察这四组小鼠在骨关节病发病早期(6月龄)与正常饮食同窝野生型小鼠颞下颌关节的表型差异,通过影像学、组织化学、免疫组织化学、相关生化指标检测和Western-blot等方法以明确氧化应激在1,25(OH)2D缺乏在导致小鼠颞下颌关节骨关节病中的作用。本研究结果表明,(1)影像学检查,1α(OH)ase-/-小鼠软骨下骨的矿化异常进一步加重,给予高钙高磷饮食后能较明显改善1α(OH)ase-/-小鼠软骨下骨的矿化异常,但骨密度仍低于野生型小鼠。给予高钙高磷饮食及NAC水后,其软骨下骨的骨密度有进一步的改善。皮下注射1,25(OH)2D的1α(OH)ase-/-小鼠其软骨下骨的骨密度较野生型小鼠无明显差异。(2)组织化学及免疫组织化学染色发现,1α(OH)ase-/-小鼠软骨基质中糖胺聚糖及Ⅱ型胶原成分明显减少,给予高钙高磷饮食后1α(OH)ase-/-小鼠软骨基质中糖胺聚糖及Ⅱ型胶原成分稍有改善,但仍较低。而给予高钙高磷饮食及NAC水的小鼠其软骨基质中糖胺聚糖及Ⅱ型胶原成分进一步增加,但仍未达到野生型小鼠水平。皮下注射1,25(OH)2D的1α(OH)ase-/-小鼠其软骨基质内糖胺聚糖及Ⅱ型胶原含量较野生型小鼠无明显差异。(3)1α(OH)ase-/-小鼠软骨下骨破骨细胞数虽较多,但活性较低。给予高钙高磷饮食小鼠软骨下骨内破骨细胞明显增多;在给与NAC水后,其破骨细胞数量较单纯给予高钙高磷饮食明显减少。皮下注射1,25(OH)2D的1α(OH)ase-/-小鼠其软骨下骨内破骨细胞数量较野生型小鼠无明显差异,较给予高钙高磷饮食的小鼠明显减少。(4)我们进一步检测了颞下颌关节组织中H2O2和MDA含量,T-SO和GSH-Px活性。1α(OH)ase-/-小鼠颞下颌关节组织内H2O2及MDA含量明显增高,而T-SOD活性和GSH-Px活性均明显下降,显示抗氧化能力显著下降,发生明显的氧化损伤。在给予高钙高磷饮食后,H2O2及MDA含量较正常饮食组明显减少,而T-SOD活性和GSH-Px活性无明显增加。再进一步给予NAC水后,H2O2及MDA含量较仅给予高钙高磷饮食组进一步减少,而T-SOD活性和GSH-Px活性仍无明显增加。皮下注射1,25(OH)2D的1α(OH)ase-/-小鼠其H2O2和MDA含量、T-SOD和GSH-Px活性较野生型小鼠无明显差异。(5)1α(OH)ase-/-小鼠软骨内氧化应激导致DNA损伤相关指标及细胞衰老指标明显增高,在给予高钙高磷饮食后,其软骨内氧化应激导致DNA损伤相关指标及细胞衰老指标有一定程度的降低,而给予高钙高磷饮食及NAC水后,其软骨氧化应激导致DNA损伤相关指标及细胞衰老指标进一步降低,但仍高于野生型小鼠。皮下注射1,25(OH)2D的1α(OH)ase-/-小鼠其DNA损伤相关指标及细胞衰老指标较野生型小鼠无明显差异。为了进一步探讨1,25(OH)2D3缺乏导致小鼠颞下颌关节骨关节病是否与NF-κB信号通路激活导致炎症因子增多有关,我们分别利用免疫组织化学和Western Blot方法检测了p-P65及p-IκBα的表达变化。结果显示:1α(OH)ase-/-小鼠颞下颌关节组织内p-P65及p-IκBα的表达明显增高,且其下游重要炎症因子IL-1α表达水平也明显增高,给予高钙高磷饮食后,其p-P65、p-IκBα及IL-1α的表达水平有所下降,给予高钙高磷饮食及NAC水的小鼠,其其p-P65、p-IκBα及IL-1α的表达水平进一步下降,但仍高于野生型小鼠。皮下注射1,25(OH)2D的1α(OH)ase-/-小鼠其相关指标较野生型小鼠无明显差异。本部分研究结果提示,1,25(OH)2D的缺乏可导致小鼠颞下颌关节组织内氧化应激水平增高,进而导致软骨细胞的DNA损伤,加速软骨细胞衰老进程,继而产生衰老相关分泌表型,并通过激活NF-κB信号通路产生的炎症因子,导致了颞下颌关节OA的发生、发展。


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