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子痫前期病理相关血清蛋白定量新方法的研究及临床初步应用

张媛媛  
【摘要】:子痫前期是一种妊娠期特发疾病,属于妊娠期高血压疾病范畴,主要临床表现为妊娠20周后出现的高血压合并蛋白尿,而当无蛋白尿存在时合并神经、血液、消化等系统,或心、肝、肾、肺等重要器官中任一受累。无论是在发达国家还是在发展中国家,子痫前期仍然是引起孕产妇及围产儿患病率及死亡率增高的主要原因。目前,对于子痫前期的临床治疗仍缺乏有力有效的措施,只能采取降压、解痉等对症治疗。由于子痫前期的发病机制相当复杂,尽管多年来对子痫前期发病机制的探讨一直是产科研究领域的难点、焦点,但到目前为止,仍无一种理论可以全面满意地阐述其病因,且鲜有单独的血清学生物标志物可以进行准确且特异的预测。同时,传统血清学痕量检测随着现代检测技术的不断发展,在灵敏度、特异性和响应速率等方面受到了限制,目前亟需发展集成化、自动化、高效、灵敏、特异的血清学定量分析新方法。因此,本论文采用电化学生物传感检测体系,针对子痫前期病理相关的几种血清蛋白设计了多个相适应的定量检测方案。这些方法实现了临床血清样本中子痫前期病理相关生物活性物质的定量分析,借助电化学检测体系的诸多性能优势,有望将子痫前期的早期标志物检测筛查进一步推向实用化。1、基于肽核酸双重循环信号放大的子痫前期病理相关血清蛋白高灵敏定量新方法目的:蛋白质类激素作为激素家族的重要成员,可通过调节各种组织细胞的代谢活动,对机体生理过程起调节作用。胰岛素是由胰腺内的胰岛β细胞分泌的蛋白质类激素,可促进脂肪、糖原、蛋白质合成,是控制碳水化合物和脂肪代谢的中心。血液中胰岛素水平的异常不仅与糖尿病等代谢疾病相关,更可通过激活或者抑制机体内的相关信号通路,参与子痫前期等多种疾病的发生及发展。因此本文设计了一种新型的电化学传感器通过肽核酸(PNA)偶联的双重DNA循环以及纳米复合材料的应用使得检测信号获得多重放大,达到对胰岛素高灵敏定量分析目的。方法:1.电化学传感器的构建、电极界面修饰。2.实验条件优化:工具酶浓度、ZrOC12溶液浓度、胰岛素与发夹状DNA探针作用时间、双重DNA循环扩增时间、金纳米颗粒/DNA/亚甲基蓝纳米复合体与电极的孵育时间。3.采用方波伏安法(SWV)研究不同放大步骤对检测体系灵敏度的影响。4.采用SWV对胰岛素标准品进行检测、获得定量标定曲线。5.运用对照实验对检测体系的特异性进行研究。6.在正常孕妇血清中加入不同浓度胰岛素标准品,研究本法的回收率等特性。7.将本定量方法与商用ELISA试剂盒进行比较研究,以验证本方法的适用性。8.选取2013年11月~2014年6月,在我院住院并分娩的子痫前期孕妇和正常孕妇各6例,对其胰岛素水平进行检测,以进一步研究检测体系的准确性和临床适用性。结果:1.实验条件优化:(1)工作酶的最优浓度为0.25 U/μL。(2)ZrOCl2溶液的最适浓度为0.25 mM时,可保证纳米材料对信号的级联放大效果。(3)120分钟的孵育时间即能保证胰岛素与发夹状DNA探针充分的相互作用。(4)双重DNA循环扩增时间以80分钟最佳。(5)金纳米颗粒/DNA/亚甲基蓝纳米复合体与修饰了 DNA探针的电极孵育的最适时间为60分钟。2.在1-500pM之间,SWV峰电流与胰岛素浓度的对数呈线性关系,线性拟合方程为:y=2.46x+1.71,检测下限小于1pM,平均变异系数小于5%。3.电极表面与溶液相中的DNA循环过程和金纳米颗粒/DNA/亚甲基蓝纳米复合体不同程度地提高了检测体系灵敏度。4.经特异性研究显示,对照组产生的背景信号可忽略不计。5.标准化检测显示检测浓度与加入标准化胰岛素的实际浓度误差5%。6.与商用ELISA试剂盒相比,本方法的灵敏度更高,线性检测浓度范围更广。7.经本方法检测,在正常孕妇体内胰岛素水平较低,而与之形成对比的是,在子痫前期孕妇血液样本中,胰岛素的水平显著增高。结论:本电化学传感定量新方法展示出了较高的灵敏度、特异度以及在复杂生物样本中所具有的较好的适用性和准确性,可被作为快速、直接和准确的定量分析平台,在将来的临床诊断中具有很大的应用价值和广阔的应用前景。2、基于多肽生物矿化的子痫前期病理相关血清蛋白定量新方法目的:研究显示,丝氨酸肽酶1(HtrA1)的分泌水平的异常常会导致滋养细胞功能紊乱,影响胎盘着床,与子痫前期的发生密切相关。因此,开发针对体内外HtrA1的快速、准确、特异的定量新方法有助于子痫前期的预测和诊断。另一方面,随着子痫前期病程进展,会出现胎盘钙化等病理条件下的生物矿化过程。我们将这两方面联系起来,利用HtrA1的靶向多肽探针设计了多肽生化矿化级联放大反应,通过形成多肽-金属纳米结构,获得灵敏和高特异性的检测品质。方法:1.电化学传感器的构建、电极界面修饰。2.运用紫外吸收光谱对银纳米颗粒进行表征。3.采用原子力显微镜(AFM)对生物矿化后的电极表面进行研究。4.应用高分辨率扫描电镜(HRSEM)和高分辨率透射电镜(HRTEM)对多肽纳米线上富集的银纳米颗粒形态进行研究。5.采用圆二色散(CD)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)对多肽构象变化进行研究。6.运用电化学交流阻抗法(EIS)对电极表面修饰情况进行表征。7.实验条件优化:修饰电极与靶标HtrA1的孵育时间、多肽纳米线的形成时间以及工具酶浓度。8.运用动态光散射(DLS)研究溶液的pH对银纳米颗粒大小和均一性的影响。9.采用MTT法对银纳米颗粒的生物细胞毒性进行了检测。10.采用方波伏安法(SWV)对不同浓度HtrA1标准品进行检测、获得定量标定曲线。11.运用对照实验对本方法的特异性进行研究。12.选取2014年12月~2015年6月,在我院住院并分娩的子痫前期孕妇和正常孕妇各6例,对其HtrA1表达水平进行检测,以进一步验证本方法的适用性和准确性。13.将本方法与商用ELISA试剂盒进行对比,以验证本方法的适用性。结果:1.通过紫外吸收光谱显示,在信号多肽存在的情况下,发生生物矿化的溶液中出现了银纳米颗粒的特征性吸收峰。2.由AFM、HRSEM及HRTEM显示,生物矿化后多肽周围产生了大小稳定的银纳米颗粒。3.由CD和FT-IR证实多肽结合了银纳米颗粒后二级结构发生了改变。4.在电极经过不同修饰反应步骤后,EIS响应都发生了相应改变。5.实验条件的优化:(1)2小时已足够底物多肽探针的电极与靶标HtrA1的相互作用。(2)100分钟定为形成多肽纳米线的最佳时间。(3)工具酶的最优浓度为0.3mg/mL。6.在检测中运用适中的pH即可产生较小且相对均一的银纳米颗粒。7.只有在足够大量的银纳米颗粒存在的情况下,细胞的活力才会下降。8.在50-2800 pg/mL范围之间时,LSV的峰电流与HtrA1的浓度的对数成线性关系,其线性方程为:y=115x-137,检测下限是21.7pg/mL,平均变异系数小于5%。9.经特异性研究显示,对照组的产生的背景信号可被忽略不计。10.经本方法检测,HtrA1在子痫前期孕妇体内表达水平高于正常孕妇。11.与商用ELISA试剂盒相比,本定量方法具有较好的适用性。结论:本电化学传感定量新方法表现出较高效的检测性能,做到了低背景信号、高稳定性及高灵敏度的分析检测,可以在未来作为高效灵敏的机体内疾病靶标水平检测及分析平台。3、基于肽核酸适体的子痫前期病理相关血清蛋白定量新方法目的:鉴于患有子痫前期的妊娠妇女常处于血栓前状态,且促凝和抗凝机制的失平衡、凝血机制障碍是其发病机制之一。因此对再次妊娠前、妊娠期及产后的妇女的高凝状态进行监测,关注其凝血指标的变化,对于评估子痫前期患者病情的发生发展和预后有着重要的意义。凝血酶生成增高是体内血栓前状态的直接证据,因而对其浓度及活性的监测,有助于诊断子痫前期患者的血栓前状态,并对评估子痫前期的发生发展和预后有重要参考价值。因此利用凝血酶的肽核酸适体序列设计了 DNA的循环切割信号放大反应,并在临床血清学样本中初步达到了灵敏和特异的定量分析性能。方法:1.电化学传感器的构建、电极界面修饰。2.运用电化学交流阻抗法(EIS)对电极表面修饰情况进行表征。3.实验条件优化:肽核酸(PNA)和电极孵育时间、界面上循环侵入切割的时间以及S1核酸酶的工作浓度。4.采用方波伏安法(SWV)对不同浓度凝血酶标准品进行检测、获得定量标定曲线。5.运用对照实验对检测方法的特异性进行研究。6.选取2015年6月中在我院产科住院并分娩的正常孕妇3例,在其血清中加入标注化凝血酶进行检测,以进一步验证方法的准确性和临床适用性。结果:1.在电极经过不同修饰反应步骤后,EIS响应都发生了相应的改变。2.实验条件的优化:(1)80分钟已足够PNA和电极的相互作用。(2)界面上循环侵入切割的时间以120分钟最优。(3)S1核酸酶的最适浓度为5U/mL。3.在凝血酶的浓度处于63 pM-40nM范围之间时,SWV的峰电流与凝血酶的浓度的对数成线性关系,其线性方程为:y = 2.11x+1.94,检测下限是27.4 pM,平均变异系数为4.5%。4.经特异性研究显示,对照组的产生的背景信号可被忽略不计。5.对实验得到的相应SWV的信号峰值进行了换算,计算出的浓度与加入靶标的实际浓度误差5%。结论:此种设计充分考虑和利用了电化学界面传感的基本设计布局,通过改造肽核酸适体序列,使其实现靶标蛋白识别、DNA切割双功能切换,从而实现对生物靶标分子的高效定量分析。本电化学检测体系可应用于任一拥有适体的疾病靶标的特异性检测,因而本方法可被作为快速、灵敏和准确的定量分析平台,在将来的临床诊断中发挥重要作用。


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