IL-35在DSS诱导IBD小鼠模型中的表达和分子机制的研究

【摘要】：在成功建立DSS诱导IBD小鼠模型,研究IL-35对于肠道免疫耐受的影响,并进一步探讨其机制。第一部分初步分析DSS诱导IBD小鼠模型中IL-35的表达和意义目的:初步分析DSS诱导IBD小鼠模型中IL-35的表达和意义材料与方法:本课题采用Balb/c雌性小鼠5-6周龄,体重15-20g,将小鼠随机分为实验组20只(口服4%DSS),对照组10只(口服蒸馏水),实验过程中每天记录小鼠体重、皮毛、精神状态及排便情况,7d后处死小鼠,收集血清用酶联免疫吸附试验(ELISA),检测血清中IL-35的表达水平;分离肠道组织使用qRT-PCR和免疫组化、Western Blot对肠粘膜组织中的表达进行分析,结果采用统计学分析。结果:血清IL-35的表达:IBD小鼠模型中血清IL-35的表达水平显著低于对照组,差异有统计学意义;肠道黏膜IL-35的表达:qRT-PCR检测实验组中EBi3和IL-12a表达水平高于对照组,差异有统计学意义,免疫组化提示IL-12a、STAT1肠道组织中高表达,做表达于肠道间质,Western Blot结果显示IL-12a,STAT1模型组表达高于对照组,差异有统计学意义。结论:IL-35在IBD小鼠模型血清中含量下降,在病变肠道组中表达升高,IL-35可能作为保护性因子,在IBD发病过程中起到一定作用,可能会成为IBD新的检测和治疗靶点。同时研究发现IL-35可能通过STAT1的信号通路参与IBD发病。本实验研究较为局限,仍需进一步结合临床病例,分子生物学实验完善IL-35的分子机制。第二部分SHIP1对巨噬细胞系的增殖和凋亡的影响目的:通过调控miR-155与SHIP1的表达,分析SHIP1对RAW264.7和BMDM细胞系的增殖和凋亡,探讨SHIP1在巨噬细胞增殖中的作用。材料与方法:1、首先通过靶标分析软件数据库miRBase,PicTar和miRanda,结合文献报道筛选出SHIP1基因突变相关miR-155的作用靶点;2、其次构建用靶点双荧光素酶报告载体,与miR-155mimics及miR-155inhibitor共转染在RAW264.7和BMDM中,观察miR-155是否能够与靶基因3'-UTR区中预测的位点结合;3、实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western-blot(WB)检测miR-155对SHIP1 mRNA和蛋白的表达的影响4、通过MTT实验观察调控miR-155和SHIP1蛋白的表达对细胞系增殖的影响,5、通过ELISA检测转染后RAW264.7和BMDM中炎性因子IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-γ的表达情况。结果:1、利用生物软件预测到miR-155靶基因位点。2、通过构建含有miR-155靶基因位点的双荧光素酶报告载体,证实了miR-155能与SHIP1上靶基因位点结合,并且可以抑制SHIP1mRNA和蛋白的表达。3、MTT实验分析发现过表达miR-155促进细胞增殖,上调SHIP1蛋白表达抑制细胞增殖,比较有统计学意义(p0.05)4、ELISA分析过表达miR-155诱导IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-γ,上调SHIP1 表达可以抑制IL-6,TNF-α,IL-1β和IFN-y过表达(p0.05)结论:调控SHIP1的表达可以缓解miR-155对于巨噬细胞活化及源性炎性因子表达的影响。第三部分IL-35对IBD小鼠模型巨噬细胞极化的影响目的:初步分析IL-35对IBD小鼠模型中巨噬细胞极化的影响及机制初步研究材料与方法:用Balb/c雌性小鼠5-6周龄,体重15-20g共30只,设立对照组、模型组(口服4%DSS 7d)、IL-35干预组(口服4%DSS 7d,第2d至第5d,腹腔注射2ug/只),每组10只。7d后处死小鼠,留取血清和肠道组织,进行HE染色观察各组结肠组织病理形态变化;流式细胞技术检测各组M2型巨噬细胞的数量变化;免疫组化检测各组肠道组织SHIP1的表达;RT-PCR检测各组肠道组织中SHIPlmRNA的变化和Western-blot检测各组肠道组织中SHIP1蛋白的表达情况。同时检测对照组、模型组、IL-35干预组中巨噬细胞极化因子的表达情况。结果:对照组、DSS模型组、IL-35干预组模型构建成功;IL-35干预组结肠炎较对照组和模型组损伤程度减轻;IL-35干预组较模型组M2型巨噬细胞数量增加,提高M2/M1比值;IL-35干预组较模型组SHIP1蛋白的表达增加。IL-35干预组较模型组M2型极化相关因子的表达增加。结论:IL-35能缓解DSS诱导的IBD小鼠模型,可能通过调控SHIP的表达,促进M2巨型细胞极化有关。