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MicroRNA 384靶向Notch信号通路参与内耳毛细胞损伤修复的相关性研究

陈智斌  
【摘要】:目的:目前认为两栖类、鸟类等低等动物的内耳毛细胞损伤后能部分修复和再生,但哺乳类动物(包括人类)的耳蜗毛细胞损伤不可逆而前庭毛细胞能少量再生。Notch信号通路在内耳毛细胞再生与修复中扮演重要角色,能够介导旁侧抑制作用,抑制毛细胞发生发育的必需基因Atoh1的表达,从而抑制支持细胞分化为毛细胞。在哺乳动物前庭毛细胞修复过程中,Notch信号通路受抑制,导致Atoh1表达上调,虽现今调控机制仍不明确,但一些研究提示micro RNAs(miRNAs)分子可能通过RNA沉默方式调控Notch信号通路中的某些重要基因。本研究旨在通过生物信息学方法筛选出内耳中靶向调控Notch信号通路的miRNAs,并在体内水平验证其对内耳毛细胞损伤修复的影响。方法:首先广泛地文献阅读搜集内耳中差异表达miRNAs,检索KEGG、String、targetscan等数据库获得Notch信号通路相关基因和miRNAs已验证与预测的相互作用关系,并绘制生物分子相互作用网络图。对网络图进行拓扑学分析,筛选核心基因并基于其提取子网络图Core-Notch。通过对Core-Notch进行拓扑学分析与GO分析,筛选目前研究较少并预测对Notch信号通路具有调控作用的miRNAs。获取小鼠包括耳蜗在内的各组织,Q-PCR检测miRNA和靶基因的组织差异性表达情况。将该miRNA的mimic转染Hela细胞,使用Q-PCR和western blot方法检测靶基因的表达量变化。使用targetscan在线工具预测miRNA与靶基因的结合位点,并基于预测位点构建靶基因3’UTR-WT-psiCHECK2表达载体,继而点突变PCR获得3’UTR-MUT-psiCHECK2载体;分别将miRNA mimic与构建的野生型或突变型表达载体共转染3T3-L1细胞,进行双荧光素酶报告基因实验验证miRNA对靶基因的调控作用。结果:本研究采用Cytoscape绘制Notch信号通路相关基因与miRNAs的相互作用网络图,并基于筛选出的核心基因Notch1和Notch2提取Core-Notch子网络图;GO分析显示其富集于Notch信号通路,验证了网络构建的可靠性,且进一步发现在内耳受体细胞命运决定等途径中也有不同程度的富集;拓扑学分析筛选出预测对Notch信号通路具有较强调控作用且目前研究较少的内耳差异表达miRNA——miR-384。Q-PCR显示miR-384在小鼠脑与内耳中特异性表达。miR-384 mimic转染HeLa细胞后,Notch1的mRNA和蛋白表达水平都显著下调。Targetscan预测miR-384对Notch1和Dll4都具有调控作用,基于预测的结合位点分别构建了Notch1和Dll4的3’UTR-WT-psiCHECK2与3’UTR-MUT-psiCHECK2表达载体,测序验证正确。双荧光素酶报告基因实验显示共转染Notch1和Dll4野生型3’UTR与miR-384 mimic质粒组荧光素酶活性都一定程度下调。结论:内耳特异性表达的miRNA-384能够靶向调控Notch1和Dll4,并可能在内耳损伤修复过程中发挥潜在的作用。


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