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MicroRNA-29b通过靶向PTEN激活AKT/β-catenin信号通路促进人脂肪干细胞成骨分化的机制研究

夏天  
【摘要】:背景:从脂肪组织中新分离得到的脂肪干细胞是一种多向分化潜能的干细胞。因其具有来源丰富、采集方便、扩增速度快且多向分化能力强等优点,近年来已成为组织工程研究的热点,很有可能广泛应用于未来的组织器官移植、基因治疗和细胞替代疗法等多个领域中。这些细胞通过多种环境刺激,通过转录和转录后水平调控的复杂途径,沿着包括成骨在内的几种特定表型进行分化。然而,细胞在成骨分化过程中途经的调节尚未完全阐明。研究ADSC成骨分化的分子机制,有助于解释骨性疾病的发病机制,促进再生治疗的发展。目的:本实验旨在阐明microRNA-29b(miR-29b)在脂肪干细胞在成骨分化过程的作用,从而探讨miR-29b脂肪干细胞成骨分化调控中的具体作用机制。进一步研究miR-29b与PTEN/AKT/β-catenin信号通路之间在此过程中的的相互作用,有助于阐明miR-29b调控脂肪干细胞成骨分化的分子机制,为骨病的预防和治疗提供新的靶点。方法:1.分离和消化选择性吸脂获得的3个脂肪组织样本,获得人脂肪间充质干细胞(h ADSCs),后进行原代培养和传代培养。将h ADSCs传代至6孔板内,在成骨特异性诱导培养基中培养21天诱导成骨分化。通过茜素红染色(Alizarin Red staining)检测成骨分化;碱性磷酸酶染色(Alkaline phosphatase(ALP)staining)检测ALP活性;通过对western blot及实时荧光定量PCR(q RT-PCR)等方法检测成骨相关标志物,成骨转录因子2(Runx2)、骨桥蛋白(OPN)、骨唾液酸蛋白(BSP)和骨连接蛋白(ON)的表达。2.通过微阵列(microarray)技术分析h ADSCs分化前后micro RNA表达谱的变化,筛选可能参与到该过程的micro RNA,通过实时荧光定量PCR验证芯片的结果。3.通过向h ADSCs内转染agmir-29b或者antagmir-29b构建miR-29b过表达或低表达模型,检测在这两种模型中miR-29b对成骨分化的影响,从而证实micro RNA表达水平变化对h ADSCs成骨分化存在调节作用的可能。4.预测miR-29b的靶基因,通过将h ADSCs转染micro RNA模拟物(mimics)/抑制物(inhibitor)构建过表达/低表达模型,检测靶基因m RNA及蛋白表达水平的变化,证实miR-29b对靶基因的调控作用。5.利用western blot检测miR-29b在h ADSCs成骨分化过程中对PTEN、磷酸化Akt(p-Akt)、GSK-3β与p-β-catenin的表达变化来研究PTEN/AKT/β-catenin信号通路在miR-29b调控h ADSCs成骨分化中的变化。6.利用pc DNA质粒构建PTEN过表达模型,与agomiR-29b共同转染h ADSCs,通过茜素红染色检测、碱性磷酸酶染色、检测ALP活性、western blot及实时荧光定量PCR(q RT-PCR)观察PTEN蛋白过表达对miR-29b在h ADSCs成骨分化中功能的影响。结果:1.将hADSCs传代至6孔板内,在成骨特异性诱导培养基中培养21天诱导成骨分化。通过茜素红染色,ALP定性和定量实验,Western Blot及q RT-PCR检测Runx2、BSP、OPN和OCN表达结果表明在成骨特异性诱导培养基的诱导下,干细胞早期成骨指标ALP的活性与钙盐沉积增加,成骨指标Runx2、BSP、OPN和OCN的表达升高,并且其促进作用存在时间依赖性。2.microarray技术分析结果显示与非分化细胞相比,24种micro RNAs被上调,14种micro RNAs被下调。miR-29b-3p(miR-29b)是其中最显著上调的micro RNAs之一,结合文献我们我们选择其作为本试验的研究对象。q RT-PCR结果证实,在h ADSCs分化过程中,miR-29b表达显著上调,并且其促进作用存在时间依赖性。3.通过茜素红染色,ALP定性和定量实验,Western Blot及q RT-PCR检测Runx2、BSP、OPN和OCN表达结果表明过表达miR-29b促进干细胞早期成骨指标ALP的活性与钙盐沉积,成骨指标Runx2、BSP、OPN和OCN的表达,表明过表达miR-29b过表达miR-29b。而沉默miR-29b的表达抑制h ADSCs的分化。4.生物信息学与双荧光素酶试验研究显示PTEN是miR-29b的靶点。过表达miR-29b抑制其表达,而沉默miR-29b促进其表达。进一步的研究显示PTEN在h ADSCs的分化过程中下调,并且其抑制作用存在时间依赖性。5.Western blot检测结果显示过表达miR-29b在h ADSCs成骨分化过程中对磷酸化Akt(p-Akt),p-GSK-3β与p-β-catenin的表达有明显的促进作用,暗示我们miR-29b在h ADSCs成骨分化过程中能够激活PTEN/AKT/β-catenin信号通路。6.进一步的研究显示过表达PTEN能够反转过表达miR-29b在h ADSCs成骨分化过程中的促进作用。结论:1.miR-29b在hADSCs成骨分化过程中表达显著上调,并且其促进作用存在时间依赖性,过表达miR-29b能够促进h ADSCs成骨分化。2.miR-29b通过靶向PTEN促进h ADSCs成骨分化。3.miR-29b与PTEN/AKT/β-catenin信号通路相互作用组成了一个调控环路共同参与了h ADSCs成骨分化的调控。


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