FasL逆转录病毒体系的构建及诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究

【摘要】： 目的：（1）构建大鼠FasL基因逆转录病毒体系，并研究FasL在 包装细胞PA317中的表达；（2）用PA317/pLXSN-FasL+病毒上清体外 转染肿瘤细胞，以观察其对肿瘤细胞的诱导凋亡作用；（3）将FasL基 因导入供体源的树突状细胞，注入受体体内后，观察其对肝移植大鼠 生存期的影响，并探索转FasL基因治疗诱导免疫耐受的可能机理。 方法：（1）将含FasL基因的质粒pBL-KA15用XhoⅠ酶切，获得 大鼠全长FasL cDNA片段，将该片段与同样经XhoⅠ酶切的逆转录 病毒载体pLXSN在T4嗜菌体DNA连接酶作用下进行相同突出端的 连接反应，并鉴别其正反向，将正向单拷贝插入的重组子pLXSN-FasL 用脂质体转染试剂盒导入双嗜性逆转录病毒包装细胞PA317中，用 G418筛选，获得病毒滴度高的抗性克隆，命名为PA317/pXSN- FasL+；用PCR及RT-PCR方法检测该包装细胞是否有FasL基因整 合及mRNA的表达，并以流式细胞仪检测包装细胞表面FasL的表达。 （2）将PA317/pLXSN-FasL+体外转染淋巴瘤细胞株Jurkat、Raji、Daudi， 肝癌细胞株HepG-2及骨髓瘤细胞株SP2/0，用流式细胞仪分别检测 这些细胞株表面Fas及FasL的表达，并用Annexin V-PI法检测这些 细胞的凋亡，通过细胞增殖实验观察PA317/pLXSN-FasL+病毒上清 对Raji、Daudi、SP2/0及HepG-2细胞株的生长抑制。(3）首先建立“二 袖套法”大鼠肝移植模型，并在袖套管制作，受体麻醉，肝上下腔 静脉、门静脉及肝下下腔静脉吻合等方面进行技术改进，行供体为SD 大鼠、受体为Wistar大鼠的肝移植48例，并分为4组：①对照组12 例，不作任何治疗；②mdrl组12例，移植前腹腔注射转mdrl基因 的DC细胞；③CsA治疗组，术后给予环孢霉素（CsA）治疗；④转FasL 南京医科大学悍十学位论文 基因治疗组，移植前腹腔注射转FasL基因的DC细胞。肝移植术后 3d及 7d分别杀死各组4只大鼠，取出外周血及肝脏，检测肝功能， 半定量 RT－P皿检测移植肝 FasI虬、IL4 的 InRNA表达，TU’N’E‘ 法检测肝细胞及外周血淋巴细胞凋亡；光镜及透射电镜观察移植肝的 病理及超微结构，同时观察各组大鼠肝移植后生存期。 结果：O 重组子经酶切鉴定后获得正向单拷贝插入 子，脂质体介导法导入N3细胞后，m18 筛选出抗性克隆，命名 为 PA3 7MSNlasL＋，测得病毒滴度为 4．7 xlo’CFUth。PCR及 RTPCR证实 PA317细胞有 FasL基因整合及 wA表达，流式细 胞仪检测出PA3 17包装细胞表面有高强度的F虬分子表达。仅）流式 细胞仪检测 Jim’ai、oaudi、Rat、SPz／0及 HyG上细胞株 eas阳性率 分别为 99．8％、33．9％、68＊％、72％、sl．7％Z用 PA317／pLXSN－FasL＋ 病毒上滑转染 oaucti’ Rat’ sn：vo及 Hpcrz细胞株后，east阳性率 分别为 99．l％、99．4％、86．l％、72．3％，AnneAn VFI法捡测细胞凋亡 率分别为 30．50、31．30、12．l％、19．40；细胞增殖实验提示转 FasL 后肿瘤细胞株生长受到明显抑制。o）对“二袖套法”大鼠肝移植进 行技术改进后，无肝期明显缩短，肝移植成功率明显提高；供体SD 大鼠的骨髓经体外扩增后，获得表型特异的DC，将之转染FasL基 因后移植前受体腹腔注射，结果发现对照组及mdrl组移植后945d 死亡，血清胆红素及转氨酶明显高于 CsA组及 FasL组，病埋学及透 射电镜提示有肝细胞变性、坏k，6 CsA fAA F吼组肝细胞免疫排 斥较轻，肝移植大鼠生存期已超过4个月；半定量RTPCR结果示 对照组及mdrl组术后7d F嘛、IL《2表达增高，而CsA组及F札 组F虬及几12则呈不表达或低表达；刀l田L法检测发现FIL组 有明显外周血淋巴细胞凋亡，透射电镜结果也证实肝组织内有凋亡的 淋巴细胞。 结论：＊）建立的 PA317／pLXSNFasL＋逆转录病毒体系能有效地 表达 F虬八 PA3 7／pLX狲F虬＋能有效地诱导 Fas高表达肿瘤细 胞凋亡，井对这些肿瘤细胞的生长有抑制作用。o准D大鼠为供体， 4 南京医科大学博士学位论文 Wistar大鼠为受体的肝移植是一个高排异组合，是用于研究移植耐受 埋想的模型；经转染FasL基因的DC治疗后可有效地诱导肝移植免 疫耐受，其机理是诱导活化T细胞凋亡，并一定程度地减少ILJ 的 分泌。