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FasL逆转录病毒体系的构建及诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究

孙倍成  
【摘要】: 目的:(1)构建大鼠FasL基因逆转录病毒体系,并研究FasL在 包装细胞PA317中的表达;(2)用PA317/pLXSN-FasL+病毒上清体外 转染肿瘤细胞,以观察其对肿瘤细胞的诱导凋亡作用;(3)将FasL基 因导入供体源的树突状细胞,注入受体体内后,观察其对肝移植大鼠 生存期的影响,并探索转FasL基因治疗诱导免疫耐受的可能机理。 方法:(1)将含FasL基因的质粒pBL-KA15用XhoⅠ酶切,获得 大鼠全长FasL cDNA片段,将该片段与同样经XhoⅠ酶切的逆转录 病毒载体pLXSN在T4嗜菌体DNA连接酶作用下进行相同突出端的 连接反应,并鉴别其正反向,将正向单拷贝插入的重组子pLXSN-FasL 用脂质体转染试剂盒导入双嗜性逆转录病毒包装细胞PA317中,用 G418筛选,获得病毒滴度高的抗性克隆,命名为PA317/pXSN- FasL+;用PCR及RT-PCR方法检测该包装细胞是否有FasL基因整 合及mRNA的表达,并以流式细胞仪检测包装细胞表面FasL的表达。 (2)将PA317/pLXSN-FasL+体外转染淋巴瘤细胞株Jurkat、Raji、Daudi, 肝癌细胞株HepG-2及骨髓瘤细胞株SP2/0,用流式细胞仪分别检测 这些细胞株表面Fas及FasL的表达,并用Annexin V-PI法检测这些 细胞的凋亡,通过细胞增殖实验观察PA317/pLXSN-FasL+病毒上清 对Raji、Daudi、SP2/0及HepG-2细胞株的生长抑制。(3)首先建立“二 袖套法”大鼠肝移植模型,并在袖套管制作,受体麻醉,肝上下腔 静脉、门静脉及肝下下腔静脉吻合等方面进行技术改进,行供体为SD 大鼠、受体为Wistar大鼠的肝移植48例,并分为4组:①对照组12 例,不作任何治疗;②mdrl组12例,移植前腹腔注射转mdrl基因 的DC细胞;③CsA治疗组,术后给予环孢霉素(CsA)治疗;④转FasL 南京医科大学悍十学位论文 基因治疗组,移植前腹腔注射转FasL基因的DC细胞。肝移植术后 3d及 7d分别杀死各组4只大鼠,取出外周血及肝脏,检测肝功能, 半定量 RT-P皿检测移植肝 FasI虬、IL4 的 InRNA表达,TU’N’E‘ 法检测肝细胞及外周血淋巴细胞凋亡;光镜及透射电镜观察移植肝的 病理及超微结构,同时观察各组大鼠肝移植后生存期。 结果:O 重组子经酶切鉴定后获得正向单拷贝插入 子,脂质体介导法导入N3细胞后,m18 筛选出抗性克隆,命名 为 PA3 7MSNlasL+,测得病毒滴度为 4.7 xlo’CFUth。PCR及 RTPCR证实 PA317细胞有 FasL基因整合及 wA表达,流式细 胞仪检测出PA3 17包装细胞表面有高强度的F虬分子表达。仅)流式 细胞仪检测 Jim’ai、oaudi、Rat、SPz/0及 HyG上细胞株 eas阳性率 分别为 99.8%、33.9%、68*%、72%、sl.7%Z用 PA317/pLXSN-FasL+ 病毒上滑转染 oaucti’ Rat’ sn:vo及 Hpcrz细胞株后,east阳性率 分别为 99.l%、99.4%、86.l%、72.3%,AnneAn VFI法捡测细胞凋亡 率分别为 30.50、31.30、12.l%、19.40;细胞增殖实验提示转 FasL 后肿瘤细胞株生长受到明显抑制。o)对“二袖套法”大鼠肝移植进 行技术改进后,无肝期明显缩短,肝移植成功率明显提高;供体SD 大鼠的骨髓经体外扩增后,获得表型特异的DC,将之转染FasL基 因后移植前受体腹腔注射,结果发现对照组及mdrl组移植后945d 死亡,血清胆红素及转氨酶明显高于 CsA组及 FasL组,病埋学及透 射电镜提示有肝细胞变性、坏k,6 CsA fAA F吼组肝细胞免疫排 斥较轻,肝移植大鼠生存期已超过4个月;半定量RTPCR结果示 对照组及mdrl组术后7d F嘛、IL《2表达增高,而CsA组及F札 组F虬及几12则呈不表达或低表达;刀l田L法检测发现FIL组 有明显外周血淋巴细胞凋亡,透射电镜结果也证实肝组织内有凋亡的 淋巴细胞。 结论:*)建立的 PA317/pLXSNFasL+逆转录病毒体系能有效地 表达 F虬八 PA3 7/pLX狲F虬+能有效地诱导 Fas高表达肿瘤细 胞凋亡,井对这些肿瘤细胞的生长有抑制作用。o准D大鼠为供体, 4 南京医科大学博士学位论文 Wistar大鼠为受体的肝移植是一个高排异组合,是用于研究移植耐受 埋想的模型;经转染FasL基因的DC治疗后可有效地诱导肝移植免 疫耐受,其机理是诱导活化T细胞凋亡,并一定程度地减少ILJ 的 分泌。


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