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东亚钳蝎毒素BMK AS类多肽的分离纯化及对大鼠骨骼肌细胞内[Ca~(2+)]_i的影响

黄晓莉  
【摘要】: 第一部分:东亚钳竭毒素BmK AS类活性多肽的分离与纯化 本论文第一部分进行了各类东亚钳蝎毒素多肽的分离和纯 化研究。先使用常规柱层析(Sephadex G-25,Sephadex G-50, DEAE Sephadex A-25)方法,对东亚钳蝎粗毒进行分离,获得 相对纯度的目标活性多肽;然后用反向高效液相色谱(RP- HPLC)法进行反复纯化。结果显示:东亚钳蝎粗毒经Sephadex G-25柱可得到3个峰;其中第一峰的Sephadex G-50图谱显 示又可分为5个峰;取其第二峰进行DEAE Sephadex A-25柱 层析,共有5个峰;然后对其中的第四峰进行RP-HPLC分析, 显示共有3个峰;最后分别对这三个峰进行反复的RP-HPLC纯 化,显示第一峰和第三峰成分较单一,纯度较高,用SDS-PGA 电泳鉴定,均分别显示出单一的谱带,且分子量在7500左右。 第二部分:东亚钳蝎毒素多肽BmK AS’对大鼠骨骼肌细胞中 游离钙浓度的影响 利用荧光染料FlllO刁 可以和细胞内游离钙结合,与钙结 合后荧光增强,且荧光强度与细胞内游离钙浓度成正比的原 理,采用激光扫描共聚焦显微镜技术观察东亚钳竭毒素多肽BmK AS’对原代培养的大鼠骨骼肌细胞内游离钙浓度的影响。实验 结果显示:1)细胞外有钙情况下,l,30X10-’、l.30X10-‘’气 1.30xl0J’、0.65x10-“M 64 BmK AS’均能明显增力。i田胞内钙荧 光值。2妄月PF无钙情况下,1.30X10习、130X10l’、130X10门、 0*sxlo 1M白 BmK AS’同样能明显增力。胞内钙荧光值。3)在 兰月 夕有钙条件下,随着BmK AS’浓度的增力,妾月 内钙 荧 光值也增加,有明显的剂量反应关系。4)当 BmK AS’浓度为 130xl*‘、130x10J‘、0.65x10J“时,无论细月夕有无钙 离 于,其细胞内钙荧光值无明显差异 5)当 BmK AS’浓度为 1.3 0 XIO-’M时,兰月外有钙的情况下,月 内钙荧光值增力。要明 显高于细胞刮、无钙的情况,说明其作用除了细胞内钙库的释 放,还有可能是通过细胞膜上的钙离子通道,使细胞外丐进。 胞内,从而引起胞 内钙的升高。6)无论胞夕有无钙,BmK AS’ 引起细胞内钙升高到最高峰所需的时间较长,约为950秒,而 KCI作用所需的时间只有不到30秒,这其间有着显著性差异。 提示:在较低浓度下(引*OX m-’勺,BXK ASd起胞内钙的 升高不是通过细胞外钙的内流,而是主要通过胞内机制,即可 能是通过细胞内钙库的释放。而浓度较高时,(21.3 XIO-门, 月 内钙白升高是胞 内机朱和胞外机牛共同作用的结果。


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