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精子发生相关基因的克隆及功能研究

朱虎  
【摘要】: 哺乳动物的精子发生是一个极其复杂的过程。在曲精小管中的生精细胞经过漫长的分化过程,最终生成精子。生精过程中发生了许多生物学的变化,如精原细胞的自我更新,精母细胞的减数分裂和精子细胞的变形。精子发生是成年睾丸的一项重要的功能,许多在睾丸中特异性和/或高度表达的基因参与完成这一过程。 为了寻找与精子发生相关的基因,我们采用了两种策略:1.差异显示PCR 分离曲精小管中的DNA含量为2n和4n的细胞群,比较两群细胞的基因表达差异,获取在4n细胞中特异表达的表达序列标签(expressed sequence tags ESTs)。2.人睾丸CDNA微阵列杂交 从人睾丸文库中PCR扩增插入片段,将PCR产物点膜制备成cDNA微阵列,然后提取胚胎和成人睾丸的mRNA,制备成探针,分别与微阵列进行杂交,获取差异表达克隆。 在第一种策略中,我们从4n细胞中得到6个EST片段,其中有一个EST(R5)与小鼠胞浆内的9-O-乙酰酯酶具有高度同源。人睾丸cDNA文库中筛选后,我们得到该基因的两个不同的转录本,人唾液酸特异的9-O-乙酰酯酶Ⅰ(homo sapiens sialic acid-specific acetylesterase Ⅰ HSEI)和人唾液酸特异的9-O-乙酰酯酶Ⅱ(homo sapiens sialic acid-specific acetylesteraseⅡ HSEⅡ)。HSEⅠ cDNA长度为1990bp,在410bp至1876bp间有一个开放阅读框架,编码488个氨基酸。基因序列输入GenBank中,登录号为AF300796。HSEⅡ cDNA长度为2750bp,在13bp至1584bp间有一个开放阅读框架,编码523个氨基酸,GenBank登录号为AF303378。 HSEⅠ和HSEⅡ蛋白质的氨基酸序列基本相同,只是HSEⅡ的N端多出35个氨基酸。通过在GenBank中 南京医科大学颀士研究主毕业论义 查询,HSEI和 HSEll定位于人N 号染色体长臂的 2区 4带,它们在基困组上的9个外元是一致的,但是HSEI 的前两个外元和 HSEll的第一个外元是不同的。这说明 它们是一个基因的两个转录本,使用了不同的转录起始 位点。同时很奇怪的是 HSEI的外元但25刁 74b)与 SP(Sperm autoantlgenic protein)基固的一个卜元 厂 70J gbp)在基因组上处于同一位置上,只是它们使 用了不同的模板链进行基因转录。用高分辨率的TNG 放射杂交试剂盒进行基因染色体定位,结果显示HSE基 因是定位于人的* 号染色体上。HSEI和 HSEll组织分 布的 Northern blot结果显示膜上共有三条带,其大小分 别约为 2,7kb,6.okb和 7.skb。~2.7kb的条带是HSEll, 它广泛地表达于多组织中,其中在睾丸、大肠和前列腺 是高表达。6.okb和刁.skb的条带可能是新的HSE基 因的转录本。原位杂交结果显示杂交信号位于成人睾丸 曲精小管腔的初渊母细胞和精子细胞中,精原细胞、 管周细胞和曲精小管外的间质细胞中无任何信号。用 GFP高合蛋白的技术确定HSEI和HSEll 在细胞中勺定 位,结果显示HSEI-GFP均匀地分布于细胞浆中,而 HSEll0FP则分布不均匀,在胞浆有聚集成许多荧光信 号很强的点。HSEI和HSEH在细胞核部位都没有信号。 在第H种策略中,我们共发现有592个克隆在成人 睾丸中高表达,表达强度是胚胎睾丸的3倍以上。测序 后发现其中共有 317个独立基因,其中有 42个新基因和 90个新6勺睾丸特异6勺转录本(testis-specific transcripts)。 我们对其中的一个睾丸特异的转录本一钙激活的中性蛋 白酶古制物(testi-specific calpastatin tCAST),和两个 新的全长基因一ND七P27和人泛素样融合蛋白山uman ublqultln-like usion protein hwP)进行了进一步研究。 人睾丸CDNA微阵列杂交后,tCAST基因的成人睾 丸探针杂交信号为 137.5,胚胎睾丸探针杂交信号为 38.02,成人信号是胚胎信号64 3.62倍。tCAST核菩酸 -2- 南京医科大学硕士研究生毕业论文 长度为2290hp,编码590个躺酸,GenB毗的登录号 为AF327443。经过与GenB毗中的序歹。]进行比较后, 我们发现它与人的体细胞中表达的钙激活的中性蛋白酶 抑制物 (somati calpastatin sCAST)高度同源。同时它 们也存在着一定的差异:汇AST的第一个外元O’端的 109 hp)位于 SCAST的第四和第五个外元之间,成为一 个的新的外元;SCAST的 第 11个外元在 tCAST中是 缺失的。所以 tCAST的转录可能使用了在睾丸中特异的 启动子,从而使用了一个新的剪切模式。这样生成了一 种截断的蛋白,N端缺少105个躺酸,中间缺失了13 个氨基酸。Northern blot结果中共有三个条带,大小分 别为:2.3讪,2.skb和 4.6 kb。其中~2.skb和~4.6kb的 条带在各组织中广泛表达,但是在睾丸中表达最强。~ 2.skb的条带是SCAST,~4.6kb的条带则是一种从禾发 现过的新的转录本。~2.3kb的条带是tCAST,特异性的 高表达于睾丸。 NYD丑P27基因成人睾丸探针杂交信号为74.69,$ 胎睾丸探针杂交信号为8.25,成人睾丸表达强度胁胎 睾丸的 9.05倍。


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