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胰岛素样生长因子I对其受体在肿瘤细胞中表达调节的实验研究

王俊宏  
【摘要】: 胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-IR)是一跨膜受体,由α和β两个亚单位组成,它广泛表达于多种类型的细胞的表面,介导了IGF-Ⅰ(胰岛素样生长因子Ⅰ)和大部分IGF-Ⅱ的生物学活性,它可以促进机体的蛋白质和核酸DNA的合成以及碳水化合物的代谢。而且它与细胞的生长分化,胚胎的发育密切相关,当其表达过度时,细胞则可以向恶性表型转化。在多种肿瘤中(包括乳腺癌、结肠癌、小细胞肺癌等)都已检测到IGF-IR及其配体的表达异常。本实验通过研究,比较了非小细胞肺癌细胞株A549细胞和淋巴细胞在外源性rIGF-Ⅰ的作用下,在细胞转录水平上,其自身IGF-IR的表达变化。本实验同时研究了这两种细胞在血清撤除情况下,其IGF-IR的表达情况,并初步探讨了IGF-IR在肺癌发生及发展过程中的作用。 [目的] 研究肺腺癌细胞株A549细胞和淋巴细胞在外源性胰岛素样生长因子Ⅰ作用下,各自IGF-Ⅰ受体(IGF-IR)mRNA的转录情况。同时研究血清撤除对两者rIGF-Ⅰ受体表达变化的影响,探讨在肺癌发生过程中IGF-IR表达失控的机理,为非小细胞肺癌的诊断和治疗提供一定的理论依据。 [材料和方法] 实验分两个部分来研究外源性rIGF-Ⅰ对A549细胞和淋巴细胞IGF-IR mRNA表达的影响。在实验第一部分中研究了在一固定浓度的rIGF-Ⅰ的刺激下,细胞IGF-IR的表达情况。实验采用RPMI 1640+10%小牛血清(完全1640培养液)体外培养非小细胞肺癌A549细胞,待细胞处于指数生长期时用2.5g/L的胰 南京医科人学硕十学位论文 酶消化细胞,用完全 1640培养液稀释细胞,计数后接种于 6孔细胞 培养板,培养24 h待细胞贴壁生长后弃去培养液,改用无血清的1640 培养液(不全 1640培养液)培养 12 h后;每孔加入一定量的 rIGFJ 至终浓度为 20 "g/ml,按 0、入 4、8、16 h不同的时问点收集细月轧 淋巴细胞采用 RPMI 1640+4%N“AB”血清直接培养于 6孔培养板, 培养 24 h后弃去培养液,改用不全 1640培养液,培养 12 h后同样 加N rIGFJ至每孔中终浓度为 20 ng加l,按上述相同的时间点收集 兰胞。实验同时设不力。rIGF-I白 空白对照,在才同的 日 间点d 集细 胞。细胞收集后用 Tripure提取 NA,以细胞内表达恒定的天冬氨酞 合成酶基固(*幻作为内参照,采用一步法RT七*R试剂盒同时扩增 AS和mFJ 基困。扩增产物于 2y琼脂糖凝胶电泳,摄像后采用 Kodak凝胶图象分析软件分析两者表达强度,利用公式积分光密度 (10m IGF.IR/10DAS对 1** IR*RNA进行才对定量。,实验第二吾 分按第一部分相同的方法培养淋巳细胞和AS“9细胞,按终浓度为 0、5、20、80、160、320 ng/ml各刁加入才应的 rIGF,并根据第 一部分实验结果确定的最佳作用时间点收集细胞,提取RNA,进行 RTICR基固扩增定量分析观察不同浓度 rIGFJ作用对淋巴细胞和 A549卓月各自 IGF mRNA表达的影响。 【结果11.淋巴细胞和AS叩细胞在撤除血清的无血清培养液中 培养后*F-IR m叫A的转录均呈反应性上调,至血清撤除 16 h后 这种作用达到平台期。血清撤除刺激可以上调淋巴细胞IGF.IR mRNRNA的转录至 4倍于基础水平,而对于 A549细胞,这种作用可 以使其IGF-IR mRNA升高至2倍于其基础水平。2.rIGF的作 用迅速,20 ng/ml的 rIGF-I作用 8 h后 gF V kX下调淋巴细胞 IGFJ m叫A至接近于基础水平。3.i血清培养的 A549 f邮胞与 20 ng/ml的 rIGF-I乡 育 16 h后,其mF-IR m叫A的转录与无 rIGF- I作用的空白对照相比无明显改变。4.淋巴细胞和 A549细胞被不 3 南京医科人学硕十学位论义 同浓度的 rlGFJ的作用后出现不同的反应。对淋巴细胞而言,其 IGF-IR m删A对rlGF-I的反应呈齐量负寸关,当 rIGF-I浓度增 力。至 20 ng/ml后,IGF-IR mMA耳出现显著降低。而 A549兰胞 IGF mRNA的转录水平贝与 IGF的刺激无明显才关性,即使 rIGFJ的浓度增加至320 "g/ml,其瞩FJ m伽A的转录水平仍 未发生明显改变。 [结论]1.rIGFJ不能上调 A549细胞自身受体的表达,说明对 于A549兰胞,1日F-1并非引起其自身IGF-IR过度表达的一个因素。 2.淋巴细胞可以通过负反馈调节机制在转录水平下调细胞IGF-1受 体的表达来对抗过度rIGF的刺激。3.A549细胞被过量的 rIGF 刺激后,其*F-IR mMA的转录表现为无反应性,说明在转录水 平,A549细胞存在某种机制使互GFJ受体已逃避了这种自身负反馈 调节,证明IG卜1受体在肿瘤细胞恶性转化和增殖过程中具有重要 的意义。4.rIGF-I主要通过与细胞表面自身受体结合来发挥作用; 当 rIGF-I6勺来激达 20 ng/ml或以上时,细胞表面白勺mF-IR已被过 度的 rIGF-l所饱和,因而正常细胞 IGF m删A的转录不再有明 显的变化。5.因血清撤除而引起的饥饿反应可以上调正常细胞 IGF- IR mRNA的转录,它也可以在转录水平


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