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JWA,一种新的微管相关蛋白,对细胞内氨基酸平衡有重要调节作用

李爱群  
【摘要】: 人类疾病往往是环境因素与遗传因素共同作用的结果,人体对环境因素易感的基因也非常多,探讨基因与环境的相互作用,有利于我们掌握环境诱导疾病的分子遗传机制。1998年,周建伟等人从培养的原代人的气管和支气管上皮细胞中,利用差异显示高通量筛选技术,分离克隆了一个在生物进化上高度保守的环境应答基因——JWA基因,其编码蛋白在细胞内的分布酷似微管蛋白,并受多种分化诱导剂如维甲酸(RA)、13顺-维甲酸(13-cRA)和佛波酯(TPA)等调控,可能参与了诱导急性早幼粒细胞性白血病细胞分化和凋亡,以及环境热应激、氧化应激应答的信号转导通路。国外研究人员最近连续报道,与JWA基因几乎完全同源的大鼠E18表达的蛋白GTRAP3-18可能是一种与Na~+依赖的谷氨酸转运体EAAT3相关作用的新蛋白,并且负调控EAAT3介导的谷氨酸摄取。本研究内容共为二个部分:第一,在结构上探讨JWA蛋白与微管蛋白之间的关系;第二,进一步研究JWA蛋白参与调节PC12细胞内氨基酸转运,特别是谷氨酸-牛磺酸平衡的功能。 南京医科大学硕士学位论文 第一部分JWA蛋白与微管蛋白相关性的研究 针对微管动力学、微管及其相关蛋白共纯化的特性,我们采用 4℃解聚一3 7 C聚合循环法纯化和提取了 SD大鼠脑组织中微管及 其相关蛋白,发现 JWA蛋白也同时伴随微管蛋白共纯化而非是污 染性蛋白,说明 JWA蛋白是一种特异性地与微管蛋白相互作用的 分子;在用微管解聚剂门0HM诺考达哇)处理及对照的NIH3T3 细胞裂解液进行免疫共沉淀实验中,结果表明无论微管处于解聚或 聚合状态,p-微管蛋白均可与JWA蛋白免疫共沉淀;免疫胶体金 法电子显微镜技术显示JWA蛋白与微管蛋白在超微结构水平上有 共定位。激光共聚焦检测显示JWA基因编码蛋白定位于细胞浆中, 核周围分布比较密集,呈放射网络状分布直达细胞膜,酷似微管蛋 白。双重荧光素染色实验中观察发现JWA蛋白与p-微管蛋白分布 平行,有共定位,这一结果与免疫胶体金电镜实验结果相吻合。秋 水仙素和诺考达哇处理 HBE细胞后,JWA和微管均发生解聚;低 温(4C)处理转染pCMVflag刁WA的 HBE细胞后发现微管发生 解聚,而 JWA未受明显影响;但在另一实验模型中显示,低温(4 C)、终浓度为 10州的秋水仙素分别处理 NIH3T3细胞 0、30、60、 1叨分钟后,微管和J他均不同程度地发生解聚。用m卜M J帅 反义寡核菩酸处理NIH3T3细胞24,1、时后;J狐蛋白表达明显下 降。用50pM的秋水仙素处理细胞,发现J皿蛋白在细胞分裂间 期中的分布与p-微管蛋白基本一致,而在细胞分裂中期中,JWA 蛋白好象包绕在纺锤丝周围,成为纺锤丝的包裹。 第二部分TWA蛋白参与调节PC12细胞内氨基酸的平衡 用针对JWAcDNA不同部位及不同修饰的六种反义寡核普酸 处理PC圭月后(10HM,二hL各处理组细月 内20种氨基酸总 量以及抑制性氨基酸:甘氨酸,Y氨基丁酸和牛磺酸,兴奋性氨基 酸:谷氨酸和天冬氨酸的含量均比对照组有不同程度增加,其中六 种不同的反义寡核菩酸中以和对PC12细胞内氨基酸转运的影响 最为显著(P<0.of);两类氨基酸中又分别以牛磺酸(P<0.of)和 3 南京医科大学硕士学位论文 谷氨酸o刃.01)受到的影响最为显著,J皿反义寡核旮酸对细胞 内两类氨基酸转运影响大小次序为:牛磺酸>抑制性总氨基酸>谷 氨酸>兴奋性总氨基酸卜-氨基丁酸>甘氨酸>天冬氨酸。 综上实验结果表明JWA蛋白是一种新的微管相关蛋白,与微 管分布基本平行,在绝大多数情况下伴随微管动力学(聚合或解聚) 变化而同步发生变化,并且可能对细胞有丝分裂中微管重组、染色 体移动等发挥了一定的作用;同时JWA蛋白也是细胞内负性调节 氨基酸含量的一种重要蛋白,选择性地调节了细胞内谷氨酸和牛磺 酸的平衡。


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