黄芪甲苷和苄达赖氨酸对早期糖尿病肾病的防治作用及其机制

【摘要】：背景 糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见的并发症，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一，正在成为我国乃至全世界医药界面临的重要挑战。DN的发病机理极为复杂。长期高血糖引起的多元醇代谢通路激活、蛋白质非酶糖基化、蛋白激酶C过度活化、葡萄糖转运蛋白激活从不同环节促进了DN的病理进程，细胞因子表达失衡、氧化应激以及由此引起的肾脏血流动力学改变在病程中也起着非常重要的作用。根据以上发病机理，寻找阻断病理进程中的某些关键环节并以此为靶标进行药物设计，如抑制醛糖还原酶(aldose reductase, AR)、抑制糖基化终末产物(advanced glycated end-products, AGEs)的生成、对抗转移生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)以及调控一氧化氮(nitric oxide, NO)和对抗氧化应激等，是目前DN治疗药物的发展方向。 黄芪为补气要药，具有补气升阳之功效。黄芪甲苷(Astragalus Saponin I,ASI)是黄芪的有效成分之一，具有多种与DN防治有关的药理作用，如抗氧化应激、改善血流动力学、免疫调节等。苄达赖氨酸(bendazac lysine, BDL)对糖性白内障及其它多种类型的早期白内障有预防和治疗作用，其药理机制是抑制AR、抗炎、抗蛋白变性、抗自由基等，这些同样是DN发病进程中的重要环节，因此BDL可能是一个颇具潜力的抗DN药物，值得深入研究。 迄今为止，大多数的DN治疗药物仅对影响DN发病的极其复杂网络中的某一环节进行调节，作用较为单一，特异性不强，且副作用较多，加上DN中的重要致病因素AGEs的生成为不可逆过程，因此疗效皆不甚理想。所以，对ASI的研究将有助于阐明ASI防治DN的科学内涵，并为开发符合国际标准的黄芪制剂打下坚实基础。这不仅在DN的治疗药物上增加了一个新品种，而且用现代医学理论技术丰富了中医对黄芪的″异病同治″和补气理论，为发掘祖国医药遗产做出贡献。此外，ASI和BDL对DN的治疗作用各有千秋，作用位点和作用强度各不相同。在本研究中，我们还初步观察此两药合用对DN治疗的相加或增强 南京医科大学博士学位论文 作用，尝试摸索治疗DN的有效复方制剂。以上研究将大大强化DN治疗药物的 多靶点作用的特点，对DN药物的开发大有裨益。 目的 1观察Asl对DN大鼠的治疗作用，寻找ASI治疗DN的作用位点，为开发符 合国际标准的黄茂制剂提供理论依据和临床前实验资料。 2根据整体DN大鼠的实验结果，在体外培养的大鼠肾系膜细胞上研究高糖与氧 化应激及DN之间的关系，继续观察Asl对高糖引起的细胞氧化应激状态、一 氧化氮合成酶(nitric oxide synthetase，NOs)、W型胶原、层粘蛋白以及TGF一pl 的影响，阐明ASI治疗DN的部分药理学机制。 3观察BDL对DN大鼠的治疗作用，验证我们关于BDL可以用于治疗DN的假 设，并寻找BDL治疗DN的有效作用位点，为增加BDL用于DN防治的新 的适应症提供药理学依据。 4在整体DN大鼠的研究基础上，在体外培养的大鼠肾系膜细胞上继续研究BDL 对DN症状的改善作用的靶点，以阐明BDL治疗DN的机制。 5在牛晶状体提取的AR上，观察并比较Asl和BDL对AR的抑制机制和抑制 强度。 5在了解ASI和BDL对DN的治疗原理的基础上，运用体外培养的大鼠肾系膜 细胞初步观察两药合用对DN治疗的相加或增强作用，探索ASI与BDL成为 复方制剂的可能性。 方法 1 sD大鼠一次性腹腔注射链脉霉素(streptozotoein，sTZ)6omg·kg一‘诱导糖尿 病模型，空腹血糖封3.88~ol一’者入选。 2成模的DN大鼠按分组分别给予低中高剂量的ASI(3、6、12 mg.kg一，)和 BnL(1 00、200、400 mg·kg一‘)，治疗s周。 3 DMEM培养液培养大鼠肾系膜细胞，分别加入含低中高剂量的ASI(2 xlo一7、 Zxxo一6、Zxlo一smol·L一，)、BnL(10一6、10一5、一。一4mol·L一‘)及Asl和BDL 合用(Zxlo一，+10一6、2又10一6+10一，mol·L一‘)的nMEM培养液36小时后， 收集细胞并测定。 南京医科大学博士学位论文 4以流式细胞仪测定培养细胞的细胞周期;葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖;放 免法测定尿白蛋白;亲和层析法测定糖化血红蛋白(HbA IC);化学比色法 测定尿素氮(BUN)和肌配;荧光分光光度法测定肾皮质和血清中AGES含 量;ABTs比色法测定总抗氧能力(total anti一oxidativee即ability，T一AOC); 铝酸比色法测定过氧化物酶(catalase，CAT);DJINB比色法测定谷胧普肤 (GsH);硝酸还原酶法测定血清中NO水平;化学比色法测定总NOs(tNOS) 和诱导型NOS( iN0s)活性;DL一甘油醛一NADPH一荧光分光光度法测定全血 AR活性;放免法测定肾皮质中W型胶原和层粘蛋白含量;RT一PCR法测定肾 皮质TGF一田n1RNA的相对含量;光镜和电镜观察大鼠肾脏组织形态学变化 并测定基底膜(glomerular base membrane，GBM)厚度。 5 DL一甘油醛一NADPH一紫外分光光度法测定牛眼晶状体AR活性，并以酶促动 力学原理判断抑制类型并计算Asl对AR的抑制常数。 6比较DN大鼠与正常大鼠，各治疗组大鼠与DN大鼠的各项指标的变化，以 确定早期DN模型的建立和各剂量的ASI和BDL对DN各指标的作用。比 较高糖和HZOZ培养细胞与正常培养细