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日本血吸虫复合表位及其在CpG ODN协同下诱导的Th1应答对小鼠的免疫保护作用

李光富  
【摘要】:血吸虫病(schistosomiasis)是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,我国受威胁的人群达1亿。控制血吸虫病的传播和流行,根除血吸虫病的危害是几代血吸虫病研究者追求的目标。 以吡喹酮反复群体化疗,辅以灭螺的综合防治手段,在血吸虫病的防治上产生了显著的效果。但要预防血吸虫的感染和再感染,应优先考虑血吸虫病疫苗的发展。而阐明血吸虫病免疫保护的机制是研制血吸虫病疫苗的前提条件。目前,有关细胞免疫和体液免疫在血吸虫感染中的作用仍然存在很大的分歧。一种观点认为,Th2型细胞介导的体液免疫在血吸虫病获得性免疫中占主导地位,抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)作用对童虫的杀伤是血吸虫病感染后获得性抗力的基础;另一种观点认为,机体CD4~+T细胞向Th1极化,产生高水平的IFN-γ,提高机体的细胞免疫水平与获得性抗力间存在显著的正相关;还有一种观点认为,血吸虫病的免疫保护力是体液免疫、细胞免疫及其他细胞和补体成分协同作用的结果。本研究拟从专一性诱导宿主Th1型免疫应答为出发点,从不同疫苗候选分子中筛选T细胞表位,制成复合表位蛋白疫苗或复合表位核酸疫苗。并筛选对小鼠有最佳免疫刺激活性的CpG ODN,以优势诱导Th1极化的CpG ODN、IL-12为佐剂,观察复合表位及CpG ODN、IL-12协同复合表位优势诱导的Th1型应答对小鼠抗日本血吸虫感染的作用,为探索日本血吸虫病疫苗研制的新途径和探讨日本血吸虫感染的保护性免疫机制提供有益的实验研究资料。为此,本文进行了以下几个方面的研究。 一、日本血吸虫中国大陆株28kDaGST的基因克隆及其高效表达产物的纯化和鉴定 为获得日本血吸虫中国大陆株28kDa谷胱甘肽转移酶(Sj28GST)基因及其基因工程表达产物,本研究从GenBank中查找Sj28GST编码基因序列,设计特异性的上游引物P1和下游引物P2,分别带有NcoⅠ和XhoⅠ内切酶位点。应用引物特异性PCR技术,从日本血吸虫中国大陆株(江西地理株)成虫cDNA文库中扩增Sj28GST基因。经琼脂糖凝胶电泳,切下与Sj28GST编码基因大小一致的条带并纯化。克隆入pGEM-T载体(Promega),挑选单克隆菌培养提取质粒,用上游 南京医科大学博士学位论文 引物PI和下游引物PZ进行二次扩增,纯化后分别用上游引物Pl和 下游引物PZ进行双向碱基序列测定。然后用限制性内切酶Ncol和 xhol分别双酶切纯化的PcR片段和载体pET32c(+),切胶纯化并重 组连接,构建sj 28 G sT一TRx融合蛋白重组表达载体 (sj 2 8 G sT/pET32e(+)),并经双晦切鉴定。结果显示:获得的sj28GsT PcR产物大小为约64obp。经测序证实其编码碱基序列为633bp,碱 基序列与GenBank报道一致。编码2!1 aa。重组质粒经双酶切产生长 64obp的nNA片段,表明成功地构建了sj28GsT一TRX重组质粒。将 重组质粒转化大肠杆菌(E.coll’)B LZI(DE3),用IPTG诱导其在E.。011 BLZI(nE3)中的表达。用western一blotting坝,]定以融合蛋白方式表达 的Sj28GsT的免疫反应性。SDs一PAGE显示表达产物中有分子量约 43kDa的表达蛋白条带。sDs一PAGE和western一blotting检测表明, sj28GsT一TRx融合蛋白与羊杭sj28GST抗体呈现特异性反应条带,表 明该融合蛋白具有良好的免疫反应性。 为获得高纯度重组融合蛋白sj 2 8 G sT一TRx,用于动物免疫及其T 细胞表位的鉴定,对其表达产物的纯化方法进行了研究,并制备了高 纯度重组融合蛋白sj28GsT一TRx。用IPTG诱导重组基因工程体 sj 2 8 G sT/pET32e(+)/百.eoli BLZI(DE3)大量表达,离心收集表达菌体, 经冻融、超声裂解后离心,获得包涵体形式表达的重组融合蛋白。采 用分步洗涤的方式,洗涤包涵体。加入含有高浓度盐酸孤的变性缓冲 液溶解。上样到镍柱中进行亲和层析,分布收集洗脱产物。SDS一PAGE 结果显示:纯化的重组融合蛋白Sj 28 G ST一TRx显示单一条带。该产 物经复性和透析后低温贮存备用。 二、日本血吸虫重组28GST的T细胞表位的鉴定 为鉴定日本血吸虫重组28GST的T细胞表位,本研究用软件预测 日本血吸虫重组28GST抗原分子T细胞表位谱,筛选4种较好的T 细胞表位,并进行人工合成。用照射尾坳感染C57BL/6小鼠(H一2”), 并用重组融合蛋白sj 2 8 G ST一TRx加强免疫,用红细胞裂解法从脾脏 中制备单个核林巴细胞,并用合成肤进行刺激。通过淋巴细胞增殖试 验、ELISA及流式细胞术等,体外测定其促进淋巴细胞增殖,淋巴细 胞分泌IFN一v、IL一2,及CD4+T细胞中IFN一v+和IL一4+T细胞比例, 分析各种表位的免疫刺激作用。结果显示:在4个候选表位中,P1 南京医科大学博士学位论文 (73一81aa)是刺激脾单个核细胞增殖的作用最强,其活化脾单个核细 胞的上清中IFN一Y的浓度是ZI.84ng/L、IL一2的浓度是53.6ng/L, IFN一v十T CellS与IL一4十T CellS的比在.J是l,18:l。表明,PI是有效的 Thl型细胞表位。 为筛选最佳的Thl型细胞表位,本研究又筛选了下列5个候选表 位,进行进一步鉴定。分析P1仅有9个氛基酸组成,将其向N端和 C端分别扩展5个氨基酸,命名为P5和 P6;并选取与曼氏血吸虫28GST 抗原Thl型细胞表位(190一Zllaa)对应位置的多肤,命名为Pg;软 件预测重组sj28GS


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