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增加β_1和β_2-AR的表达对异丙肾上腺素损伤的大鼠心肌细胞收缩功能和存活的影响及其机制的初步探讨

孙红  
【摘要】: 心肌细胞上存在着β_1和β_2-肾上腺素受体(β_1、β_2-AR),在正常心脏中,由儿茶酚氨引起的收缩反应,主要是通过β_1-AR介导的,β_2-AR信号系统的反应较弱。心衰时,循环中儿茶酚氨水平升高,心脏对交感刺激的敏感性降低,β_1肾上腺素受体(β_1-AR)密度下调,因而,心肌的收缩能力相对减弱,出现代偿性心率加快,心肌耗氧增加,心排血量降低,导致左室舒张末压升高,心功能恶化。针对这一系列病理变化,以往应用β肾上腺素受体(β-AR)阻滞剂,通过减慢心率,降低血压,减轻后负荷,降低心肌耗氧量等,从而改善心功能。但是应用β-AR阻滞剂并没有从根本上增加心肌的收缩能力。另外,在心力衰竭和老化的心脏中由于β_1-AR的选择性下调,β_2-AR的生理作用可能显著提高,心力衰竭时β_2-AR在交感神经冲动和外源性交感激动剂产生的正性肌力作用和正性变时作用中占重要的地位。 因衰竭心肌细胞中β_1-AR密度下调,β_1-AR的作用相对增加,所以人们试图通过某些途径增加受体的密度来增加心肌收缩力。在基因敲除的动物身上过表达β_1或β_2-AR可使心肌收缩功能和舒张功能显著增强,但在心衰的大鼠心肌细胞上和儿茶酚氨损伤的心肌细胞上过表达β_1和β_2-AR是否能改善心肌细胞的收缩功能,对心肌细胞是否有保护作用,国内外报道较少。目前对儿茶酚氨导致的心肌损伤过程中,β-AR是如何变化以及起着什么样的作用也还处于不断深入的研究中。从细胞水平上探讨β_1、β_2-AR表达增加对受损心肌细胞的收缩功能的影响,有助于深入认识β-AR在心血管疾病中的作用。本实验首先用异丙肾上腺素在细胞水平上损伤心肌细胞,观察增加β_1、β_2-AR表达对心肌细胞收缩功能和死亡的影响,并对作用机制进行初步探讨;然后我们制作大鼠心衰模型,在心衰的心肌细胞上分别增加β_1、β_2-AR表达,观察对其收缩功能的影响。主要内容概括如下: 一.增加β_1和β_2肾上腺素受体表达对培养的异丙肾上腺素损伤的大鼠心肌细胞收缩功能的影响 目的:探讨增加β_1、β_2-AR表达对异丙肾上腺素损伤培养的大鼠心肌细胞收缩功能的影响。 方法:在分离、培养的心肌细胞上分别转入β_1和β_2-AR,然后在培养液中加入5μM的异丙肾上腺素慢性刺激心肌细胞,细胞培养24小时后,观察比较不同组别的单个心肌细胞的收缩幅度的变化。 结果:β_1-AR表达增加提高了培养的正常大鼠心肌细胞对异丙肾上腺素引起的收缩的幅度(P<0.01,vs control),这一效应可被选择性β_2-AR拮抗剂ICI118,551阻断(P<0.05,Adv.β_1+ICI vs Adv.β_1)。β_1-AR表达增加可使异丙肾上腺素损伤的心肌细胞的基础收缩和异丙肾上腺素刺激的收缩的幅度均降低(P<0.01 and P<0.05,respectively)。β_2-AR表达增加提高了正常培养24小时的大鼠心肌细胞的基础收缩(P<0.01,vs control)。它还提高了异丙肾上腺素损伤的心肌细胞的基础收缩和异丙肾上腺素刺激的收缩的幅度(P<0.01,Adv.β_2+ISO vs ISO)。选择性β_1-AR拮抗剂CGP20712A下调了β_2-AR表达增加的正常心肌细胞和异丙肾上腺素损伤的心肌细胞的基础收缩和异丙肾上腺素刺激的收缩的幅度。 结论:在慢性异丙肾上腺素刺激而损伤的大鼠心肌细胞上,增加β_1-AR的表达进一步加剧了因细胞损伤而引起的收缩幅度的减弱;增加β_2-AR的表达改善了损伤细胞的基础收缩和对异丙肾上腺素刺激的反应,这一作用与β_1-AR有关。 二.β_1和β_2-肾上腺素受体表达增加对培养的异丙肾上腺素损伤的大鼠心肌细胞的存活的影响与Bax/Bcl-2及Gi通路有关 目的:观察增加β_1-AR和β_2-AR的表达对培养的异丙肾上腺素损伤的大鼠心肌细胞的存活的影响并对其机制进行初步探讨。 方法:用腺病毒作载体,在培养的心肌细胞上增加β_1或β_2-AR或Gi基因的表达;然后在培养基中加入5μM的异丙肾上腺素以损伤心肌细胞,24小时后记数各组细胞的存活率,并检测Bax和Bcl-2的含量。 结果:转入β_1和β_2-AR基因后,心肌细胞上β_1和β_2-AR的含量分别为正常对照组的2.98倍和2.87倍。增加β_1-AR的表达,加剧了异丙肾上腺素引起的细胞损伤,细胞存活率降低。如果用选择性β_2-AR拮抗剂ICI118,551阻断β_2-AR的功能,可使存活率进一步下降。增加β_2-AR的表达,部分反转了异丙肾上腺素慢性刺激的毒性效应。用选择性β_1-AR拮抗剂CGP20712A阻断β_1-AR的功能,可进一步减弱因增加β_2-AR的表达而减弱的异丙肾上腺素的毒性效应,细胞的存活率提高。Western blot分析表明,和异丙肾上腺素损伤组相比,增加β_1-AR和抑制β_2-AR增加了Bax/Bcl-2的比率,而增加β_2-AR和抑制β_1-AR降低了Bax/Bcl-2的比率。Gi表达增加,对正常培养的大鼠心肌细胞的死亡率没有影响,但能够减少异丙肾上腺素损伤引起的细胞死亡。这种作用可被Gi阻断剂百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)所阻断。 结论:增加β_2-AR的表达和/或抑制β_1-AR对培养的异丙肾上腺素损伤的大鼠心肌细胞具有保护作用,增加其存活率。在同样条件下,增加β_1-AR的表达和/或抑制β_2-AR则有损害作用。这种β-ARs对细胞存活的效应与Bax/Bcl-2及Gi信号通路有关。 三.增加β_1-肾上腺素受体表达对心衰大鼠心肌细胞收缩功能的影响 目的:心衰时,β-肾上腺素受体反应性降低并伴有β_1肾上腺素受体密度下调,心肌收缩力减弱。本试验观察在心衰的心肌细胞上增加β_1-AR表达对收缩功能的影响。 方法:首先用异丙肾上腺素制作大鼠心衰模型,然后分离、培养心肌细胞,转入含人β_1-AR基因的腺病毒,24小时后Western blot检测细胞中β_1-AR的含量,并进行单个心肌细胞收缩功能的分析。 结果:心衰细胞上β_1-AR含量为正常对照组的0.56±0.19倍(P<0.01),心衰+转基因组β_1-AR的含量为正常对照组的5.68±0.36倍(P<0.01);心衰组心肌细胞对异丙肾上腺素刺激引起的收缩幅度较正常对照组明显降低(P<0.01),转入β_1-AR基因后,可明显改善心衰大鼠心肌细胞的收缩功能,选择性β_1-AR拮抗剂CGP20712A可以完全阻断转入β_1-AR后的效应,选择性β_2-AR拮抗剂ICI118,551可以部分降低心衰大鼠和β_1-AR表达增加的心衰大鼠的心肌细胞的收缩幅度。 结论:增加β_1-AR的表达,可改善心衰大鼠心肌细胞的收缩功能,这种作用可能是直接通过β_1-AR实现的。β_2-AR也参与了心衰大鼠和β_1-AR表达增加的心衰大鼠心肌细胞的收缩功能。 四.β_2肾上腺素受体表达增加对心衰大鼠心肌细胞收缩功能的影响 目的:观察增加β_2-肾上腺素受体的表达对心衰大鼠心肌细胞收缩功能的影响并对其机制进行初步探讨。 方法:分离培养心衰大鼠心肌细胞,在其上增加β_2-AR的表达,测定异丙肾上腺素刺激引起的细胞收缩幅度的改变。 结果:心衰组心肌细胞收缩幅度较正常对照组降低(P<0.01),增加β_2-AR表达可增加心衰组心肌细胞的收缩幅度(P<0.01,心衰+Adv.β_2组vs心衰组);选择性β_2-AR拮抗剂ICI118,551可部分反转这种效应(p<0.05,心衰+Adv.β_2+ICI组vs心衰+Adv.β_2组),但不能使收缩幅度降到心衰组水平(p<0.05,心衰+Adv.β_2+ICI组vs心衰组)。选择性β_1-AR拮抗剂CGP20712A可完全阻断β_2-AR表达增加的效应。 结论:增加β_2-AR表达,可使心衰的心肌细胞的收缩功能得到改善,这种作用可能与β_1-AR的功能有关。 总之,通过以上的实验我们得到如下的结论: 1.在慢性异丙肾上腺素刺激而损伤的大鼠心肌细胞上,增加β_1-AR的表达进一步加剧了因细胞损伤而引起的收缩幅度的减弱;增加β_2-AR的表达改善了损伤细胞的基础收缩和对异丙肾上腺素刺激的反应,这一作用与β_1-AR有关。 2.增加β_2-AR的表达和/或抑制β_1-AR对培养的异丙肾上腺素损伤的大鼠心肌细胞具有保护作用,增加其存活率。在同样条件下,增加β_1-AR的表达和/或抑制β_2-AR则有损害作用。这种β-ARs对细胞存活的效应与Bax/Bcl-2及Gi信号通路有关。 3.增加β_1-AR的表达,可改善心衰大鼠心肌细胞的收缩功能,这种作用可能是直接通过β_1-AR实现的。β_2-AR也参与了心衰大鼠和β_1-AR表达增加的心衰大鼠心肌细胞的收缩功能。 4.增加β_2-AR表达,可使心衰的心肌细胞的收缩功能得到改善,这种作用可能与β_1-AR的功能有关。


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