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Sublytic C5b-9诱导GMCs增殖和ECM分泌分子机制及其信号通路

高玲娟  
【摘要】: 第一部分Sublytic C5b-9诱导GMCs合成Tsp-1、TGF-β_1及其促细胞增殖和ECM分泌的作用 目的:探诗亚溶解剂量的补体C5b-9复合物(sublytic C5b-9)刺激肾小球系膜细胞(Glomerular mesangial cells,GMCs)上调血小板反应蛋白-1(Thrombospondin-1,Tsp-1)和转化生长因子-beta 1(Transforming growth factor-β_1,TGF-β_1)的基因表达,促进GMCs增殖与细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)分泌的作用。阐明Tsp-1与TGF-β_1、GMCs增殖和ECM分泌之间的相关关系。方法:在确定sublytic C5b-9最佳浓度的基础上,将体外培养的GMCs作不同的分组处理。应用Real-time PCR和Western blotting分别检测不同处理的GMCs,其Tsp-1、TGF-β_1、细胞周期蛋白(cyclin D_2)和纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)mRNA丰度和蛋白表达水平,另用ELISA法测定GMCs培养上清中活化的TGF-β_1的含量,并用~3H-胸腺嘧啶核苷酸掺入量(~3H-thymidine incorporation,~3H-TdR)检查GMCs的增殖情况。此外,利用合成的Tsp-1封闭肽段(GGWSHW,抑制TGF-β_1的活化),观察Tsp-1在由sublytic C5b-9诱导TGF-β_1的合成、GMCs增殖与ECM分泌中的作用。结果:培养的GMCs在sublytic C5b-9复合物(5%anti-Thy 1 Ab和4%正常血清)刺激后18 h,其Tsp-1、TGF-β_1mRNA和蛋白表达水平明显上调,24 h时cyclin D_2、FN mRNA和蛋白的表达亦显著增加,同时GMCs呈现明显的增殖反应。而GGWSHW(Tsp-1的封闭肽)能显著减少由sublytic C5b-9诱导的TGF-β_1的合成,并且FN mRNA和蛋白的表达水平也明显下调,但其对GMCs增殖影响并不显著。结论:Sublytic C5b-9能够诱导GMCs合成Tsp-1、TGF-β_1,促进GMCs增殖和ECM分泌,其ECM的分泌可能与Tsp-1、TGF-β_1的合成有一定的关系。 第二部分沉默Pi3-k/Akt基因对sublytic C5b-9促进GMCs合成Tsp-1,TGF-β_1及其细胞增殖和ECM分泌的影响 目的:从基因水平上探讨沉默磷脂酰肌醇3-激酶(Pi3-k)/Akt基因对sublytic C5b-9诱导Tsp-1、TGF-β_1的合成,促进GMCs增殖和ECM分泌的影响。方法:根据Pi3-k/Akt靶基因序列的不同区域设计出了8对小干涉RNA(small interference RNA,siRNA)。体外将不同的Pi3-k/Akt发夹状RNA(small hairpin RNA,shRNA)转染入GMCs后,筛选干扰效率最佳的Pi3-k shRNA(shPi3-k)和Akt shRNA(shAkt),将GMCs作相应的分组处理。以Real-time PCR检测各组GMCs中Tsp-1、TGF-β_1、cyclin D_2和FN mRNA丰度,Western blotting检测磷酸化Akt(P~*-Akt),总Akt(T-Akt),Tsp-1,cyclin D_2和FN蛋白表达水平,另用ELISA法检测各组GMCs培养上清中TGF-β_1的含量。此外,用~3H-TdR检查GMCs的增殖水平。结果:将8对shRNA质粒分别转染GMCs,发现,shPik3c3-2和shAkt1-4能明显减低GMCs中P~*-Akt和T-Akt的蛋白表达水平,而用shPik3c3-2、shAkt1-4、shPik3c3-2+shAkt1-4分别转染GMCs,再行sublytic C5b-9刺激,其Tsp-1、TGF-β_1、cyclin D_2、FN的mRNA和蛋白表达水平、GMCs增殖均明显下调,尤以shPik3c3-2、shPik3c3-2+shAkt1-4下调效果最为显著。结论:sublytic C5b-9诱导Tsp-1、TGF-β_1的合成,促进GMCs增殖和ECM分泌,其信号通路涉及Pi3-k/Akt分子的参与。


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