缺氧诱导因子1α在食管鳞癌发病机制中的研究

【摘要】： 研究背景：缺氧诱导因子是一类由异源二聚体组成的转录因子，在机体对缺氧适应性调节中发挥关键作用。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是其亚型之一，缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内，介导缺氧反应基因(HRG)的调控，产生生理效应。缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)为HIF-1的氧调节亚单位，是其活性调节中心。研究发现HIF-1α在大多数恶性肿瘤中存在表达，可通过调节血管内皮生长因子(VEGF)等表达诱导血管生成，参与肿瘤发生和发展。 目的 1、观察HIF-1α、VEGF在食管癌患者发生、发展不同阶段中表达变化及其与微血管密度(MVD)和肿瘤临床病理特征间的相关性。 2、观察缺氧状态下HIF-1α、VEGF在食管鳞癌细胞系Eca-109中的表达变化。 3、观察HIF-1α基因表达调控对食管鳞癌细胞生物学行为的影响。 4、通过裸鼠移植瘤实验，探讨HIF-1α基因表达调控对食管鳞癌生长、侵袭等行为的影响。 方法 1、采用免疫组化和原位杂交方法检测42例食管正常上皮、40例食管鳞状上皮不典型增生和67例食管鳞癌组织中HIF-1α、VEGF mRNA和蛋白表达，分析在食管鳞癌发生、发展不同阶段HIF-1α、VEGF表达变化；以CD31作为微血管密度(MVD)指标，分析(1)HIF-1α、VEGF表达与MVD的相关性；(2)HIF-1α、VEGF和MVD与肿瘤临床病理特征的相关性。 2、在正常氧分压和低氧条件下Eca-109细胞传代培养，采用RT-PCR和Western-Blot方法检测HIF-1αmRNA和蛋白表达变化。 3、利用RNA干扰技术构建重组质粒pGCsi-H1-shHIF转染Eca-109细胞：(1)通过RT-PCR及Western Blot观察HIF-1α基因沉默后Eca-109细胞株中HIF-1α、VEGF、HO-1、MMP-2、PTEN表达；(2)流式细胞仪分析HIF-1α基因沉默后Eca-109细胞生长变化；(3)细胞增殖实验观察其增殖活力改变。 4、HIF-1α基因沉默后Eca-109细胞株和普通Eca-109细胞株植入裸鼠体内，对比观察移植瘤生长情况。 结果 1、在食管正常鳞状上皮-不典型增生上皮-鳞癌组织中HIF-1α、VEGF在mRNA和蛋白水平表达呈逐步升高趋势，MVD值显著增加，组间差异明显；鳞癌组织HIF-1α蛋白表达与VEGF蛋白表达呈正相关，且HIF-1α、VEGF蛋白表达与MVD值呈正相关；鳞癌中HIF-1α、VEGF蛋白表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期正相关。 2、Eca-109细胞中HIF-1αmRNA水平在缺氧组较正常氧组明显升高；VEGF mRNA的表达水平与HIF-1αmRNA表达一致；HIF-1α蛋白水平在缺氧状态下与正常氧状态下相比无显著差异。无论在正常氧还是缺氧状态下HIF-1α蛋白的表达均存在磷酸化及去磷酸化两种形式。 3、pGCsi-H1-shHIF成功转染Eca-109细胞，有效抑制HIF-1α基因表达并稳定传代；伴随HIF-10α基因沉默同时出现VEGF、HO-1、MMP-2、PTEN的蛋白表达均下降；HIF-1α基因沉默后Eca-109更多阻滞于G1／G0期，且细胞增殖活力较对照组明显低下。 4、HIF-1α基因沉默Eca-109细胞裸鼠移植瘤生长较普通传代Eca-109细胞移植瘤明显缓慢，移植瘤中心出现明显坏死，免疫组化提示移植瘤内HIF-1α、VEGF、MVD显著减少。 结论 1、食管鳞癌发生过程中HIF-1α、VEGF表达和MVD增加，HIF-1α可能通过诱导VEGF表达、促进肿瘤血管生成而在食管鳞癌发生发展中发挥重要作用；食管鳞癌中HIF-1α、VEGF高表达，提示两者有可能成为评价肿瘤恶性程度的指标。 2、缺氧状态下HIF-1α在食管鳞癌细胞Eca-109中有过表达，主要表现在转录水平，同时伴有VEGF mRNA的表达增加。而缺氧时HIF-1α蛋白的表达水平虽然有升高，但无统计学意义，HIF-1α蛋白在缺氧状态下的调节机制可能发生在翻译后修饰水平。 3、重组质粒pGCsi-H1-shHIF转染Eca-109细胞后能有效抑制其HIF-1α基因的表达，导致Eca-109细胞增殖活力下降，多被阻滞于G1／G0期，提示HIF-1α可影响肿瘤细胞DNA的复制合成。HIF-1α上游基因PTEN在HIF-1α基因表达受抑后也出现了一定程度的抑制，这表明在调控通路中HIF-1α对PTEN可能存在反馈调节机制。 4、裸鼠移植瘤实验证实抑制HIF-1α表达后，瘤体生长减慢，提示HIF-1α在体内肿瘤生长过程中发挥重要作用，且可能通过抑制VEGF介导的肿瘤的生长与浸润。