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人血液循环DNA的定量检测研究

陈丹  
【摘要】: 背景 循环DNA(circulating DNA),又称为游离DNA(cell-free DNA),是存在于血液(血浆或血清)、脑脊液以及滑膜液等体液中的细胞外DNA。随着微量DNA定量检测技术的飞速发展,循环DNA,特别是血液循环DNA,作为一种微创检查中的生物大分子标志物,日益受到人们的关注。人血液循环DNA含量的变化在多种类型疾病的诊断、疗效观察和预后判断中具有重要价值。然而,由于血液采集、分离、保存方式和样本选择的不同,以及循环DNA提取、纯化和定量方法的差异,各研究结果间缺乏可比性,目前关于健康人血液循环DNA水平和正常参考值范围,尚未见大样本的研究报道。 目的 建立含有内参照物的血液循环DNA定量检测方法,对健康人血液循环DNA水平进行初步研究,确定其正常参考值范围。 方法 自行设计并合成人工双链DNA片段,重组到pMD18-T质粒载体中,经基因克隆和多步筛选实验,构建重组质粒,提取质粒DNA,紫外分光光度法对其进行定量,梯度稀释获得标准内参照物。通过比较四种不同的DNA提取方法对重组质粒DNA的提取效率,选择合适的血液循环DNA提取方法。采用实时荧光定量PCR技术,以三条引物(共用一条下游引物)和两条Taqman荧光探针,同时扩增血浆和血清中的目的基因(人看家基因β-actin)和内参照物(重组质粒DNA),以扩增效率为指标,确定双重实时荧光定量PCR反应中的最佳Mg~(2+)和下游引物的浓度。由已知的标准内参照物浓度计算得到目的基因的浓度。针对不同的血浆血清用量(200、100、50、10、2和1μl)进行定量检测,确定该方法的敏感性。以紫外分光光度法定量的人基因组DNA投入空白血浆和血清中,以双重实时荧光定量PCR进行定量检测,确定其准确性。针对不同程度稀释的血浆血清DNA样品进行定量检测,确定检测方法的稳定性,并对该检测方法的重复性进行评价。 以建立的方法对100例健康人血浆扣血清DNA水平进行定量检测,分析其与性别、年龄、血细胞计数等的相关性,并确定正常参考值范围。 结果 构建了含有人工DNA片段的重组质粒DNA,经测序鉴定,与人基因组无同源性。在QIAgene、OMEGA和磁珠法DNA提取试剂盒,以及酚/氯仿法这四种DNA提取方法中,磁珠法具有最高的提取效率(71.4%)和最低的批内CV值(26%)。建立的双重实时荧光定量PCR检测方法,可在同一个反应管中同时针对目的基因β-actin和内参照物质粒DNA进行扩增,产物大小分别为91bp和99bp,分别采用以JOE和FAM荧光素进行标记的Taqman探针,可很好的区分两种产物。通过调整PCR反应体系中Mg~(2+)浓度(6 mmol/L)和下游引物的浓度(700 nmol/L),使β-actin基因和重组质粒DNA的扩增效率分别达到99.8%和90.1%。 该方法最低可对2μl血浆或血清样本进行定量测定。血浆DNA定量检测结果与紫外分光光度法比较,检测差异低于20%;血清检测差异低于30%。对于不同稀释程度的血浆血清DNA样品(分别稀释为原浓度的50%、10%和1%),定量检测结果与未稀释DNA样品的差异无统计学意义(P<0.05)。对血液循环DNA定量检测的批内差异为11%,批间差异为17%。 100例健康人血浆和血清DNA含量均呈正偏态分布,其中值水平分别为35 ng/ml和283 ng/ml(四分位数间距分别为24 ng/ml和308 ng/ml),两者差异具有统计学意义,P值小于0.001。血浆与血清DNA含量之间存在正相关关系,相关系数r为0.52,P值小于0.001。血浆血清DNA含量无性别差异及年龄相关性,与白细胞计数无相关性。按照95%的参考值范围计算,正常成年人血浆和血清DNA含量分别不超过98 ng/ml和不超过1.8μg/ml。 结论 本研究建立了带有内参照物的双重实时荧光定量PCR人血液循环DNA定量检测方法。该方法特异性强、敏感性和准确性高、重复性好,检测准确性受各种干扰因素的影响较小,使用微量血浆血清样本或经稀释后的DNA样品,仍能得到较准确的检测结果,因此本法可能具有临床应用价值。血浆样本比血清样本更适合用于血液循环DNA的定量检测。


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