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甘氨酸受体细胞保护作用的机制研究

蒋玲琳  
【摘要】: 目的: 明确甘氨酸受体(Glycine receptor,GlyR)介导甘氨酸细胞保护作用的下游信号通路,阐明甘氨酸拮抗细胞ATP耗竭性损伤的分子机制,为发现新型细胞保护剂提供理论依据。 方法: 本研究首先使用呼吸链抑制剂联合无糖培养基共同作用复制细胞ATP耗竭模型。将犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)分为ATP耗竭组和Gly(Glycine)保护组,运用Western blot检测ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2和AKT的磷酸化活性变化。分别运用ERK1/2和AKT的阻断剂PD98059、LY294002,观察各组LDH释放率的变化。将构建好的pcDNA3.1-GlyRal真核表达载体,应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入野生型人胚肾细胞(Humanembryonic kidney 293,HEK293),再用G418筛选稳定的细胞表达系。将稳定表达细胞系和野生型HEK293细胞处于ATP耗竭和Gly保护状态下,运用Western blot检测ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2和AKT的磷酸化活性变化。选用使MDCK细胞中GlyRal表达下调最明显的siRNA2,脂质体法转染入MDCK细胞,于转染后48小时使其处于ATP耗竭状态,运用Western blot观察siRNA2对GlyRα1表达的抑制效果,并运用Western blot检测ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2和AKT的磷酸化活性变化。 结果: MDCK细胞处于ATP耗竭状态下15min、30min、1h、2h后,Gly保护组与ATP耗竭组相比,ERK1/2、AKT的磷酸化活性均增强,p38MAPK的磷酸化活性减弱,而JNK1/2的磷酸化活性没有变化。分别加入阻断剂PD98059和LY294002以后,Gly保护组的LDH释放率与对照组相比均有升高。 将稳定表达GlyRα1的HEK293细胞和野生型HEK293细胞处于ATP耗竭状态1h。稳定表达细胞系中,Gly保护组与ATP耗竭组相比,ERK1/2、AKT的磷酸化活性均增强,p38MAPK的磷酸化活性减弱,JNK1/2的磷酸化活性没有改变。野生型HEK293细胞中,Gly保护组和ATP耗竭组相比,ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2和AKT的磷酸化活性均没有明显改变。 siRNA2转染入MDCK细胞48h后,MDCK细胞中的GlyRα1的蛋白表达水平明显下降达60%以上,达到实验的要求。处于ATP耗竭状态1h后,Western blot显示正常组和空转组中,Gly保护组与ATP耗竭组相比,ERK1/2、AKT的磷酸化活性增强,p38MAPK的磷酸化活性减弱,JNK1/2的磷酸化活性没有变化;而在干扰组中,Gly保护组与ATP耗竭组细胞相比ERK1/2、p38MAPK、JNK1/2和AKT的磷酸化活性均无明显变化。 结论: ERK1/2、p38MAPK、AKT是甘氨酸受体细胞保护作用的下游途径。甘氨酸与GlyR结合以后,通过增加ERK1/2、AKT的磷酸化活性;同时抑制p38MAPK的磷酸化活性,从而发挥保护细胞的作用。


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