肝细胞性肝癌中Gadd45γ的表达及其抑制肝癌细胞生长的信号通路研究

【摘要】： 原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类的健康。我国是原发性肝癌的高发国家，目前在我国的恶性肿瘤发病中居第二位。其中，肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最主要的组织类型。探讨HCC组织中异常表达基因的分子生物学机制，对于了解其发生、发展过程以及诊断和治疗，有着重要的理论和实际意义。 新近发现，Gadd45γ可以诱导人肝癌细胞HepG2发生G2／M期阻滞，但是具体的机制尚不清楚，故此，本研究就Gadd45γ在HCC组织中的表达及其抑制肝癌细胞生长的信号通路进行了初步探讨。 第一部分肝癌组织中Gadd45γ的表达及紫外线诱导对人肝癌细胞中Gadd45γ的影响 目的：观察HCC组织中Gadd45γ的蛋白表达水平及人肝癌细胞HepG2中Gadd45γ基因对紫外线的应激反应。 方法：首先，选取临床HCC标本30例，运用免疫组织化学方法检测其中Gadd45γ蛋白表达水平；其次，在体外以人肝癌细胞HepG2为实验对象，给予UVB照射，分别在照射后1h、2h和4h收获细胞mRNA和总蛋白，同时设未给予UVB照射的细胞为对照组。运用RT-PCR和Western blot分别检测各组Gadd45γmRNA和蛋白表达水平。 结果： (1)免疫组织化学染色显示，30例HCC癌组织中Gadd45γ的蛋白表达明显低于癌旁正常组织，其中17例出现了Gadd45γ表达缺失，缺失率约为57％。 (2)经UVB照射后，Gadd45γmRNA和蛋白的表达均有明显上调，于照射后1h达到高峰(分别为0.91±0.24和0.55±0.14)；此后Gadd45γmRNA和蛋白表达下降，至4h时，Gadd45γmRNA水平(0.4±0.05)与对照组(0.23±0.03)仍有差异，而蛋白表达(0.33±0.09)与对照组(0.34±0.12)相比已无统计学意义。 结论：在肝细胞性肝癌组织中存在Gadd45γ蛋白水平异常下调；UVB可以迅速诱导人肝癌细胞HepG2中Gadd45γmRNA和蛋白的表达上调。 第二部分Gadd45γ诱导人肝癌细胞G2／M期阻滞的相关信号转导通路研究 目的：探讨Gadd45γ抑制肝癌细胞生长可能涉及的信号转导通路，为研究抑制肝癌细胞生长的基因提供初步理论依据。 方法：体外培养人肝癌细胞HepG2，分别转染质粒pCMV-tag2B-Gadd45γ和pCMV-tag2B至细胞，采用western blot方法检测Gadd45γ及其下游基因P38、p-P38、JNK和p-JNK的表达变化；然后，给予信号通路的抑制剂(SB203580和SP600125)分别特异性阻断P38和JNK的磷酸化，再运用流式细胞仪检测并比较各组细胞周期，进而分析Gadd45γ诱导肝癌细胞HepG2 G2／M期阻滞可能涉及的信号通路。 结果： (1)将质粒pCMV-tag2B-Gadd45γ转染至人肝癌细胞HepG2 48h后，Gadd45γ蛋白表达至峰值为0.48±0.04，其下游的P38和JNK磷酸化水平也都明显提高。 (2)运用特异性抑制剂使P38和JNK的磷酸化表达降低，达到对照组磷酸化水平，但细胞仍表现为G2／M阻滞，阻滞程度较非抑制剂组明显减弱。 结论：在HepG2细胞中高表达Gadd45γ蛋白可以激活Gadd45γ-P38和Gadd45γ-JNK信号转导通路；Gadd45γ-P38和Gadd45γ-JNK通路参与了Gadd45γ诱导的肝癌细胞G2／M期阻滞。