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CRYAB基因在HCC中的表达、临床预后分析及抗凋亡功能研究

唐奇  
【摘要】: 在世界范围内,原发性肝癌居男性恶性肿瘤的第6位,居女性恶性肿瘤的第11位。在南非和东南亚地区,是居第2位常见的恶性肿瘤;在我国,则处于第3位。全世界每年新发肝癌26万例,其中42.5%在中国,中国肝癌死亡率为20.4/10万,占我国恶性肿瘤的第3位,是一严重危害我国人民健康的恶性肿瘤。 分子生物学研究表明,肝癌的发生是一个由多基因参与、多步骤、多阶段、由体内外因素相互作用的复杂过程。以往针对肝癌的研究仅限于个别或某几个基因,而缺少针对肝癌所涉及的众多基因全面、系统地认识,不利于肝癌发病机制、诊断、治疗等方面的研究。所以,系统地研究肝癌发生发展过程中的分子事件就显得尤为重要。 近年来克隆差异表达基因的方法不断涌现,基因芯片技术是简单、快速分离差异基因的方法之一,已被成功应用于胃肠道肿瘤、生殖系统肿瘤、心血管疾病等差异表达基因的研究。本文利用生物信息学方法对大鼠肝癌基因芯片结果进行分析和聚类,筛选高表达差异基因。对筛选出的CRYAB基因在人肝癌组织中的表达进行鉴定,并结合临床资料进行临床病理分析。最后,采用RNAi技术,抑制CRYAB基因在人肝癌细胞中的表达,研究其对细胞凋亡的影响。 研究方法: 1.利用生物信息学方法分析处理Rat Expression Array 2302.0大鼠肝癌基因芯片结果。 2.利用RT-PCR、实时荧光定量PCR和免疫组化鉴定CRYAB基因在人肝癌组织中的表达。 3.使用Kaplan-Meier方法对肝癌临床资料进行生存分析,采用COX比例风险模型进行单因素和多因素分析。 4.构建RNAi干扰载体,用脂质体将其转染至BEL7402细胞。通过免疫细胞化学和免疫荧光检测干扰载体的转染效果。通过RT-PCR、Western Blot观察干扰后,CRYAB基因mRNA和蛋白表达的改变。 5.使用MTT检测细胞增值活性,Annexin V/7-AAD双染法、PI染色法检测BEL7402细胞在转染干扰载体后,细胞凋亡率的变化。 结果: 1.对基因芯片结果进行初步和二次分析,共得到大鼠肝癌差异表达基因2242个,其中上调表达基因1227个,下调表达基因1015个。在上调表达基因中,差异度大于4的差异表达基因有60个,聚类分析后共得到96种生物学功能和48种生物学途径。 2.AlphaB-Crystallin基因(CRYAB)是筛选出的差异高表达基因之一。探针ID为No.1370026,差异度为4.3,在人肝细胞癌中未见相关报导。 3.通过RT-PCR、荧光定量PCR(差异度为4.913)和免疫组化(阳性率为42.9%)证实CRYAB基因在人肝细胞癌中高表达,与芯片预测结果相符。 4.结合98例HCC患者临床随访资料和免疫组化结果进行生存分析,CRYAB阳性表达组术后生存期与CRYAB阴性表达组有明显差异,P=0.0410,尤其是在术后18个月,阴性表达组的生存率处于稳定状态,而阳性表达组的生存率在不断下降。经多因素分析得出,CRYAB(P=0.007),静脉癌栓(P=0.037)为HCC的独立预后因素。 5.改造pRNAT-U6载体,构建pRNAT-RNAi-CRYAB干扰载体。使用脂质体转染的方法将干扰载体转染至人肝癌细胞BEL7402。利用RT-PCR、Western blot、免疫荧光、免疫细胞化学鉴定转染和干扰效果。 6.pRNAT-RNAi-CRYAB干扰载体转染BEL7402细胞后,MTT结果显示:转染48h后,转染pRNAT-RNAi-CRYAB干扰载体的细胞增殖抑制率为0.322%±0.0082%,转染pRNAT-RNAi干扰载体组的细胞增殖抑制率为0.13%±0.0356%。Annexin V/7-AAD双染法检测显示:转染24h后,干扰组细胞的早期凋亡率为5.74%±0.275%,阴性对照组细胞为3.51%±0.179%,正常细胞组为3.16%±0.185%,说明CRYAB基因具有抑制细胞凋亡的作用。 结论: 1.CRYAB基因在人肝细胞癌中高表达,可作为临床预后的独立诊断指标。 2.CRYAB基因的高表达可能与肝细胞的恶性转化、肝癌转移和侵袭能力有关。 3.pRNAT-RNAi-CRYAB干扰载体可以有效干扰CRYAB基因在人肝癌细胞中的表达。 4.CRYAB基因在肝癌细胞中具有抑制细胞凋亡的作用。


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