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前列腺素E2合成通路在口腔癌发生过程中作用的研究

张双越  
【摘要】: 前列腺素E2(PGE2)是一种重要的细胞生长和调节因子,PGE2和它的受体在促进癌症的发生过程中起着十分重要的作用。目前的研究表明PGE2可以促进细胞的增殖和分化,抑制肿瘤细胞的凋亡,促进肿瘤血管的形成。胞浆磷脂酶A2(cPLA2)和环氧化酶-2(COX-2)是PGE2合成通路中的关键因素。有研究证实cPLA2和COX-2的协同作用和某些癌症的发生密切相关,一些报道阐明了COX-2在头颈部肿瘤的发生过程中具有重要的作用。但cPLA2是否参与了口腔鳞状细胞癌(OSCC)发生过程的调控,以及在OSCC的发生过程中,cPLA2是否和COX-2具有协同作用则少有研究。 本研究的第一部分首先用免疫组化的方法研究了cPLA2和COX-2在正常口腔粘膜、口腔不典型增生、OSCC中的蛋白表达情况,并分析二者表达的相关性。同时用逆转录-聚合酶链反应研究了cPLA2、COX-2以及PGE2合成通路上环氧化酶-1(COX-1)、膜相关前列腺素E合成酶-1(mPGES-1)、膜相关前列腺素E合成酶-2(mPGES-2)的mRNA表达情况。探讨cPLA2和COX-2在促进口腔上皮细胞增殖分化中的作用,以及PGE2合成通路上的其它酶在OSCC发生过程中的作用。本研究的第二部分用COX-2的特异性抑制剂NS-398干预OSCC细胞株,通过观测细胞周期、细胞增殖的变化以及Tca8113细胞和KB细胞凋亡过程中细胞凋亡率、cPLA2和COX-2蛋白表达变化以及细胞分泌PGE2含量的变化,研究cPLA2和COX-2在调控细胞周期和抑制口腔肿瘤细胞凋亡方面的作用。通过以上的研究,明确PGE2合成通路在OSCC发生过程中的作用,为寻找OSCC化学治疗和预防新的靶点提供理论依据。 第一部分cPLA2和COX-2在正常口腔粘膜、口腔粘膜不典型增生和口腔鳞状细胞癌中的表达和意义 目的:通过观察cPLA2和COX-2蛋白在正常口腔粘膜、口腔不典型增生、口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达情况,以及cPLA2、COX-2、COX-1、mPGES-1、mPGES-2的mRNA在三种口腔组织中的表达情况,研究PGE2合成通路在OSCC发生过程中的作用。 材料和方法:收集了9例正常口腔粘膜、37例口腔粘膜不典型增生和53例OSCC的标本,部分标本制作石蜡标本并行cPLA2和COX-2的免疫组化(IHC)染色;部分标本提取mRNA,用RT-PCR观察cPLA2、COX-1、COX-2、mPGES-1和mPGES-2的mRNA在三种组织中的表达情况。 结果:cPLA2和COX-2在口腔不典型增生和OSCC中的表达明显高于在口腔正常粘膜中的表达(p<0.01);但二者在口腔不典型增生和OSCC中的表达无显著差异(p>0.05)。cPLA2在轻度不典型增生中的表达明显低于在中度和重度不典型增生中的表达(p<0.01);cPLA2在高分化、中分化和低分化OSCC中的表达无显著性差异(p>0.05)。COX-2在轻度不典型增生中的表达同样明显低于在中度和重度不典型增生中的表达(p<0.01),而在高分化、中分化和低分化OSCC中的表达无显著性差异(p>0.05)。cPLA2和COX-2的表达呈显著相关性(p<0.01)。cPLA2、COX-2和mPGES-1的mRNA在口腔不典型增生和OSCC中的表达明显高于在口腔正常粘膜中的表达(p<0.01),三者在不典型增生和OSCC中的表达无显著差异(p>0.05)。COX-1和mPGES-2的mRNA在三种组织中的表达无明显差异(p>0.05)。 结论:cPLA2和COX-2在OSCC的发生过程中具有明显的协同作用,cPLA2-COX-2-mPGES-1作为前列腺素E2的合成通路可能参与调控了OSCC的发生,提示cPLA2和mPGES-1可以作为OSCC化学治疗的新的分子靶标。 第二部分NS-398诱导的OSCC细胞凋亡过程中cPLA2和COX-2的蛋白表达变化及意义 目的:观察NS-398诱导OSCC细胞株细胞周期改变及细胞凋亡过程中cPLA2和COX-2的蛋白表达变化和凋亡相关蛋白的表达变化,以及细胞产生PGE2的变化,研究cPLA2和COX-2在OSCC细胞凋亡中的作用。 材料和方法:用25、50、75、100、200μmol/L的NS-398作用于Tca8113细胞24、48、72、96小时,用MTT法观察不同浓度的NS-398对细胞增殖的影响;用50μmol/L的NS-398作用于Tca8113细胞和KB细胞,作用时间分别为6、12、24、48和72小时。用流式细胞仪检测细胞的凋亡率和细胞周期,用western blot检测细胞cPLA2、COX-2、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平的变化,用放射免疫分析法(RIA)检测细胞产生PGE2的变化。 结果:MTT法显示:和未用NS-398干预的对照组相比较,在相同的时间点随着NS-398浓度的增加,吸光度值显著降低(p<0.01)。各用药组随着用药时间的延长,吸光度值呈下降的趋势。50μmol/L的NS-398对细胞的生长有较好的抑制作用,且细胞毒性较低。50μmol/L的NS-398作用于Tca8113和KB细胞后,随着作用时间的延长,G1期细胞数目明显增加,S期细胞数目明显减少,细胞的凋亡率明显增加。和未用药组相比,cPLA2和COX-2的蛋白表达水平显著降低(p<0.01)。随着药物作用时间的增加,cPLA2和COX-2的蛋白表达水平逐渐下调。细胞上清液中PGE2的含量显著下降(p<0.01)。Bcl-2蛋白表达水平无明显变化,Caspase-3蛋白表达水平显著增加。 结论:NS-398可以明显抑制OSCC细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性。50μmol/L的NS-398可使细胞G1期数目明显增加,在由50μmol/L NS-398诱导的OSCC细胞的凋亡过程中,cPLA2和COX-2的活性受到抑制,导致PGE2合成减少,可能通过激活Caspase-3使细胞的凋亡率增加,而与Bcl-2无关。进一步证明了cPLA2可能成为新的OSCC预防和治疗的分子靶标。


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