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β_2肾上腺素能受体减敏及其激素保护作用的蛋白质组学研究

刘华  
【摘要】: 第一部分哮喘模型及β_2受体减敏哮喘模型的构建 目的构建哮喘动物模型及β_2受体减敏哮喘动物模型,为研究β_2受体减敏及其激素保护作用的机制奠定基础。方法BALB/c小鼠随机分成四组,每组8只。分别为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组(A组),OVA致敏组(B组),OVA+沙丁胺醇组(Sal)(C组),OVA+沙丁胺醇(Sal)+地塞米松组(DXm)(D组)。B、C、D组小鼠分别于实验的第0,14和21天腹腔注射鸡OVA200μg和20mg氢氧化铝的混悬液200μl,第28天开始连续一周(每天30分钟)雾化吸入1%w/v OVA溶液;C组和D组小鼠在B组小鼠同样处理的基础上,在最后一周每天雾化吸入OVA之前腹腔注射60μg的沙丁胺醇和雾化吸入0.01%沙丁胺醇30分钟,在此基础上D组小鼠同时予以腹腔注射DXM 5mg/Kg/d,连续7天。A组小鼠腹腔注射等量的PBS,以PBS雾化吸入,作为对照。结果通过肺功能及一系列病理生理、病理形态学指标的检测,B组和C组小鼠的气道炎症程度明显重于A组和D组(p<0.05)。C组的β_2AR含量明显低于其他三组(p<0.01)。 结论成功构建了哮喘及β_2受体减敏的哮喘动物模型。 第二部分二维电泳及质谱分析 目的通过比较蛋白质组学的方法研究β_2AR减敏哮喘小鼠和哮喘小鼠以及β_2AR减敏哮喘小鼠和激素保护的哮喘小鼠差异表达的蛋白质点,为探讨机制提供依据。方法提取各组小鼠肺组织总蛋白,进行等电聚焦和SDS-PAGE垂直电泳,分离各组蛋白。通过软件分析和统计处理,发现各组间差异的蛋白质点,再行质谱鉴定,最终确定β_2AR减敏哮喘小鼠和哮喘小鼠以及β_2AR减敏哮喘小鼠和激素保护的哮喘小鼠差异表达的蛋白质。结果β_2AR减敏哮喘小鼠和哮喘小鼠有20个差异的蛋白质点,β_2AR减敏组相对于哮喘组上调的有12个,下调的有8个,其中Rho-GDI_2和Peroxiredoxin 5是我们重点关注的靶点。激素保护组和β_2AR减敏组成功鉴定差异的蛋白质点有17个,相对于β_2AR减敏哮喘组激素保扩组有13个蛋白质斑点上调,4个下调,其中Proteasome是我们感兴趣的靶点蛋白质。结论氧化应激和小G蛋白调节因子可能与β_2AR减敏有关;蛋白酶体有可能参与激素对β_2AR减敏的保护作用。 第三部分免疫印迹验证 目的通过免疫印迹法进一步确定质谱鉴定的结果,增加实验结果的可靠性和说服力。方法分别提取各组实验小鼠肺组织总蛋白,蛋白定量后,行抗原、抗体特异性结合的Western免疫印迹法验证Rho-GDI_2、Peroxiredoxin 5和Proteasome,了解目标蛋白的变化。结果β_2AR减敏哮喘组Rho-GDI_2和Peroxiredoxin 5都明显上调;激素保护组Proteasome明显下调。结论免疫印迹法进一步验证了蛋白质组学的结果,说明了氧化应激和小G蛋白调节因子可能与β_2AR减敏有关;蛋白酶体有可能参与激素对β_2AR减敏的保护作用。


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