辛伐他汀对大鼠急性心肌梗死后内皮祖细胞动员的影响及机制探讨

【摘要】： 研究背景和目的:内皮祖细胞(EPCs)是一种能直接分化为血管内皮细胞的前体细胞,它参与了缺血组织的血管新生。组织缺血后,缺血组织释放缺血相关因子,刺激骨髓中EPCs动员,最终归巢至缺血组织,参与缺血组织的修复和血运重建。已发现他汀类药物具有调节循环中EPCs水平的作用,但机制尚不完全明确。PI3-K/AKT信号转导途径是细胞内重要的信号转导通路,在细胞的凋亡、存活、增殖以及细胞骨架的变化等活动中具有重要的生物学功能,已证明他汀类药物具有激活PI3-K/AKT信号转导通路的作用,但这种作用是否与他汀对EPCs功能影响有关目前尚不清楚。本研究拟通过建立大鼠急性心肌梗死模型,观察辛伐他汀对大鼠急性心肌梗死后EPCs动员的影响;为了进一步阐明他汀促进EPCs动员的分子机制,我们观察了辛伐他汀对大鼠急性心肌梗死后血浆VEGF与AKT水平的影响,并且通过建立骨髓来源的EPCs培养模型,观察辛伐他汀在体外对EPCs的AKT、eNOS表达和VEGF释放的作用,以及PI3-K/AKT信号通路阻断剂对辛伐他汀的这一作用的影响。 第一部分:辛伐他汀对大鼠急性心梗后EPCs动员的影响 通过结扎大鼠冠状动脉左前降支,建立大鼠急性心肌梗死模型。术后当天将大鼠随机分为辛伐他汀治疗组及对照组,治疗组给予辛伐他汀20mg/kg,每日灌胃一次,空白对照组给予等量生理盐水灌胃。在术后0,1,3,5,7,11,15,20天尾静脉采血,检测静脉血中EPCs的水平。本研究中,我们定义外周血中EPCs为:表达两种大鼠干细胞表面标记即CD34和CD133的细胞群,运用流式细胞仪检测外周血单个核细胞中CD34+及CD133+的EPCs比例。结果显示:1、术前辛伐他汀干预组与空白对照组大鼠外周血中CD34+及CD133+细胞数量无明显差异(CD34+:1.16±0.34‰vs 1.14±0.40‰,P＞0.05;CD133+:0.41±0.14‰vs 0.37±0.08‰,P＞0.05)。2、在空白对照组,心梗术后第一天大鼠外周血中EPCs数量就较术前明显增加(CD 34+:5.12±3.17‰vs 1.16±0.34‰,P＜0.05;CD133+:1.32±0.27‰vs 0.41±0.14‰,P＜0.05);术后第七天EPcs动员达到高峰(CD34+:3.51±2.70‰,CD133+:1.4±0.99‰);此后EPCs数量逐渐下降,但术后20天时CD34+及CD133+细胞数量仍明显高于术前(CD34+:1.75±0.55‰vs 1.16±0.34‰,P＜0.05;CD133+:1.23±0.95‰vs 0.41±0.14‰,P＜0.05);提示心肌梗死本身即可诱可骨髓EPCs动员。3、辛伐他汀干预后外周血中CD34+及CD133+细胞数量明显增加,于术后第三天开始治疗组大鼠外周血中CD34+及CD133+细胞数量明显高于空白对照组(CD34+:4.43±1.28‰vs 2.52±1.81‰,P＜0.05;CD133+:1.49±0.65‰vs 0.84±0.54‰,P＜0.05):至观察结束(心梗术后20天)时,治疗组大鼠外周血中CD34+及CD133+细胞数量仍明显高于空白对照组,其差异具有统计学意义;提示辛伐他汀能够促进急性心肌梗死后EPCs动员。 第二部分:辛伐他汀促进EPCs动员的机制探讨 既往研究显示VEGF是促进骨髓EPCs动员的重要因素,而最近研究证实NO在骨髓EPcs动员过程中也具有重要作用。骨髓eNOS激活后,NO释放增多,促进骨髓中基质金属蛋白酶(MMP)-9表达增加,活性增强,后者可通过水解骨髓基质细胞表面的膜型kit配体,使其转化为可溶性的kit配体,解除基质细胞对EPCs的束缚作用,从而促进骨髓EPCs的动员。为了进一步阐明辛伐他汀促进骨髓EPCs动员是否由上述机制介导,我们分别进行了动物心肌梗死模型的在体研究和骨髓EPCs体外培养研究。在体实验中,通过结扎大鼠冠状动脉左前降支,建立大鼠心梗模型。术后当天将大鼠随机分为辛伐他汀治疗组及对照组,治疗组给予辛伐他汀20 mg/kg,每日灌胃一次,对照组给予生理盐水灌胃。在术后0,1,3,5,7,11,15,20天尾静脉采血,通过ELISA方法检测血浆VEGF及AKT的水平。在细胞培养实验中,我们采用密度梯度离心法收集大鼠骨髓单个核细胞,利用内皮细胞生长条件培养基进行培养,流式细胞仪鉴定EPCs表型。收集培养的第2-4代EPCs分成两组:辛伐他汀干预组:分别加入不同量的辛伐他汀,使其终浓度依次为0、0.001、0.01、0.1、1μmol/L;辛伐他汀加LY294002干预组:以PI-3K/AKT通路阻断剂LY294 002和EPCs孵育1小时后再加入不同量的辛伐他汀。24小时后收集细胞,利用ELISA方法测定细胞培养液中VEGF浓度以及细胞裂解产物中AKT和eNOS的水平,同时采用Western blot方法检测EPCs的eNOS蛋白表达水平。结果显示:1、动物实验部分,在空白对照组,心梗术后大鼠外周血中VEGF水平逐渐增高,术后第七天达到高峰(81.0±7.35pg/mL Vs 57.6±4.23 pg/mL,P＜0.05),此后VEGF水平逐渐下降,但术后20天时仍明显高于术前(64.3±7.34 pg/mL vs 57.6±4.23pg/mL,P＜0.05)。与空白对照组比较,辛伐他汀治疗组外周血中VEGF水平明显增加,于术后第三天开始治疗组大鼠外周血中VEGF水平明显高于对照组(73.17±6.31 pg/mL vs 56.5±3.78 pg/mL,P＜0.05),至观察结束,治疗组大鼠外周血中VEGF水平仍明显高于对照组,其差异具有统计学意义。在空白对照组,心梗术后大鼠外周血中AKT水平逐渐增高。与空白对照组比较,辛伐他汀治疗后大鼠外周血中AKT水平逐渐增高,于术后第三天开始治疗组大鼠外周血中AKT水平明显高于对照组(431.5±12.16 pg/mL vs 399.5±10.98 pg/mL,P＜0.05),至观察结束,治疗组大鼠外周血中AKT水平仍明显高于对照组(549.3±27.4 pg/mL vs 441.3±11.57 pg/mL,P＜0.05)。2、细胞培养部分,辛伐他汀干预后明显增加EPCs的VEGF释放水平,促进EPCs的AKT及eNOS表达,且这一效应随辛伐他汀浓度增加而增强;PI-3K/AKT通路阻断剂LY294002能够阻断辛伐他汀对EPCs的VEGF释放、AKT及eNOS表达的上调作用;提示辛伐他汀通过活化PI3-K/AKT通路促进EPCs eNOS的表达,并增加VEGF的释放。 结论: 1、大鼠急性心肌梗死可以诱导骨髓EPCs动员;辛伐他汀能够促进大鼠急性心肌梗死后EPCs的动员,且这一作用可能与辛伐他汀上调心梗后VEGF、AKT水平有关。 2、在体外,辛伐他汀能够通过活化PI3-K/AKT通路促进EPCs eNOS的表达,增加VEGF的释放,这一机制可能解释辛伐他汀对心肌梗死后EPCs动员的促进作用。