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应用旋转式生物反应器体外构建组织工程软骨的实验研究

高峰  
【摘要】: 目的: 探讨应用HFB-40型旋转式生物反应器对构建组织工程软骨的影响。 方法: 无菌条件下解剖分离3-5天龄胎兔四肢关节软骨,将软骨片剪碎至约1mm~3大小,再用0.25%的胰蛋白酶和0.2%的Ⅱ型胶原酶依次消化后获取软骨细胞。体外扩增至第2代后,收集细胞并调整细胞浓度至4×10~7/ml,将所得软骨细胞接种于1mm×4mm×4mm大小长方体聚乳酸聚羟基乙酸聚合物(PLGA)支架上,培养一周后,随机分成A、B两组,每组10个支架。A组为实验组,培养于生物反应器内;B组为对照组,培养于普通培养瓶内。A组生物反应器转速维持在15-30转/分钟,保持软骨细胞—PLGA支架复合物在震荡环境下保持悬浮状态,每2-3天换液50%-60%;B组软骨细胞—PLGA支架复合物在静止的培养瓶培养。A、B两组连续培养4周。4周后采用HE染色法观察组织工程软骨细胞增殖及分布;甲苯胺蓝染色观察软骨细胞硫酸糖氨多糖(GAG)的分泌和分布;Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察软骨细胞Ⅱ型胶原分泌和分布,并用Image-proplus图象分析系统对Ⅱ型胶原免疫组织化学染色切片行Ⅱ型胶原半定量分析;并用1,9二甲基亚甲蓝法和小牛胸腺DNA法定量检测软骨细胞—PLGA支架复合物的GAG和DNA含量。 结果: A组软骨细胞—PLGA支架复合物体积较大、较厚,表面光滑,弹性和光泽也明显优于B组,两组复合物HE染色组织学和甲苯胺蓝染色观察结果显示A组软骨细胞的生长情况明显优于B组;A、B两组Ⅱ型胶原染色面积百分比分别为(94.71±0.46)%和(63.87±1.39)%;GAG含量分别为459.167±4.682和335.282±5.110;DNA含量分别为14.25±0.147和10.84±0.112。两组之间Ⅱ型胶原染色面积百分比、GAG含量和DNA含量差异均十分明显,有统计学意义(p<0.01)。 结论: 应用HFB-40型旋转式生物反应器,能够提供更加有利于软骨细胞在PLGA中生长的外部环境,促进软骨细胞增殖,并增加Ⅱ型胶原、GAG等细胞外基质的合成,更有利于组织工程软骨的形成。


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