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丹参和仙鹤草抑制A549细胞增殖及对血管生成相关基因表达的影响

温雅  
【摘要】:我国恶性肿瘤的发病率和死亡率一直呈上升趋势,2008年全国第三次死因回顾抽样调查结果表明,恶性肿瘤是我国居民的第二大死亡原因。对于肿瘤的治疗,临床上放、化疗、手术治疗是主要治疗手段,其中手术切除肿瘤是目前根治癌症的主要方法,但一般仅适用于癌症早中期及无并发症患者,其适应范围有限。对于失去手术治疗机会及中晚期肿瘤转移的患者,放、化疗治疗十分重要,但仍存在敏感性低的问题,且对人体有较大的毒副作用。要弥补西医治疗存在的缺陷,辅以中药治疗是切实可行的。目前国内肿瘤临床治疗中,中药主要用于配合放化疗增效减毒、预防复发与转移以及缺乏有效治疗手段的中晚期肿瘤抗癌治疗。据资料统计,在我国每年新发生的癌症病人超过100万,采用手术治疗的有10%-20%,有1/3的病人接受放疗或化疗,其余有超过半数的病人接受中医药治疗、生物治疗等其他疗法。在接受中医药治疗的病人中,大约有1/3(超过15万)的病人通过治疗减轻了痛苦,寿命得到延长。大量的临床资料表明,中医药在肿瘤治疗中发挥重要的作用,临床应用前景广阔,但对中医药抗肿瘤作用的评价,现主要是凭借其临床宏观的用药经验,缺乏科学的实验数据来支撑,限制了中医药的临床应用和发展,因此对其进行深入的研究将有助于更好的发挥中医药在肿瘤治疗中的应用,并有效的指导临床用药。 实验目的:对于临床常用的几大类抗肿瘤中药中选择六味药作为代表进行抗肿瘤作用的初步研究;对理血类中药(丹参、仙鹤草)的抗肿瘤作用机制进行研究;并针对理血药对肿瘤侵袭转移作用存在的疑问,观察活血化瘀药丹参和收敛止血药仙鹤草对肺腺癌A549细胞中与肿瘤血管生成相关基因VEGF、COX-2的影响,初探活血化瘀药丹参与收敛止血药仙鹤草是否具有影响肿瘤侵袭转移的作用,以期为丹参和仙鹤草的临床抗肿瘤应用提供实验依据。 实验方法:(1)选择丹参、川芎、羊乳、仙鹤草、半夏、附子作为代表对人肺腺癌A549细胞进行体外药物筛选实验;(2)根据初筛结果,用丹参水提液进行人肺癌A549细胞,人肝癌SMMC-7721细胞,人乳腺癌MDA-MB-231细胞,人胃癌MGC-803细胞MTT体外筛选实验,根据实验结果,进一步研究丹参水提液对A549细胞的增殖抑制作用的可能机制,包括:倒置显微镜、荧光显微镜、流式细胞术;(3)用仙鹤草水提液对上述四株癌细胞进行体外筛选实验,根据实验结果,进一步研究仙鹤草水提液对A549细胞的增殖抑制作用的可能机制,包括:倒置显微镜、荧光显微镜、流式细胞术;(4)采用Real-time PCR术检测丹参、仙鹤草用药前后对A549细胞中与肿瘤血管生成相关基因COX-2、VEGF基因的表达情况。 实验结果:(1)六味药抗A549的肿瘤筛选实验结果提示,丹参和仙鹤草两味药体外抑制肿瘤细胞增殖作用最佳;(2)丹参水提液对四株癌细胞的体外筛选实验结果提示,丹参水提液对人肺癌A549细胞增殖抑制作用最好,呈剂量依赖性,且作用48h效果尤为显著;倒置显微镜和荧光显微镜观察经丹参水提液作用48h后A549细胞数目明显减少,细胞皱缩,出现凋亡细胞;应用流式细胞仪分析技术研究表明丹参水提液可以诱导细胞凋亡,其抑制细胞增殖作用可能与诱导细胞凋亡有关;(3)仙鹤草水提液对四株癌细胞的体外筛选实验结果提示对人肺癌A549细胞增殖抑制作用最好,且作用48h效果尤为显著;倒置显微镜可观察到细胞的形态学改变;细胞荧光染色出现了明显的凋亡细胞,表现为细胞皱缩、核染色质浓缩、核碎裂等凋亡特征性的形态学改变;流式细胞仪检测结果显示丹参水提液可诱导细胞凋亡,提示其抑制细胞增殖作用可能与诱导细胞凋亡有关;(4)采用Real-timePCR术定量检测丹参、仙鹤草用药前后对A549细胞COX-2、VEGF基因表达的影响,结果提示丹参水提液作用A549细胞12h后,对COX-2、VEGF基因均具有下调作用,且呈一定的剂量依赖性;仙鹤草水提液作用于A549细胞12h后,对COX-2、VEGF基因均具有下调作用,对VEGF基因的影响呈一定的剂量依赖性;对COX-2基因的下调作用最为明显,但对COX-2基因的影响不呈现剂量依赖性。这提示两味药均可通过下调与肿瘤血管生成相关基因VEGF、COX-2基因的表达,从而在一定程度上影响非小细胞肺癌的侵袭与转移,这也可能为丹参和仙鹤草水提液抑制A549细胞增殖的机制之一。 本实验结果提示丹参、川芎、羊乳、仙鹤草、半夏、附子中丹参和仙鹤草的抗A549细胞增殖作用较好;在人肺癌A549细胞,人肝癌SMMC-7721细胞,人乳腺癌MDA-MB-231细胞,人胃癌MGC-803细胞四株细胞中,丹参和仙鹤草对A549细胞的增殖抑制作用较好,且其增殖抑制的作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关;通过对A549细胞中肿瘤血管生成相关基因VEGF、COX-2基因的检测,发现二者均可下调VEGF、COX-2基因的表达,推测其可能是影响肿瘤侵袭转移的因素之一


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