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化痰除湿祛瘀剂对膝骨关节炎患者软骨及滑膜细胞影响的实验研究

孟祥奇  
【摘要】:目的:建立兔膝骨关节炎动物模型及膝关节软骨细胞分离、培养体系。探讨化痰除湿祛瘀剂影响人退变膝关节软骨细胞中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅹ型胶原和相关代谢酶MMP-1、MMP-3、 MMP-13、TNF-α、IL-1、IL-6mRNA的表达,及其延缓膝骨关节炎关节软骨退变的作用机理及临床疗效。 方法:(1)采用改良的Hulth法建立兔膝骨关节炎动物模型,观察治疗组、美洛昔康组(阳性药组)、模型组和正常关节组关节软骨及滑膜病理与超微结构的变化。(2)采用改良的Hulth法建立膝骨关节炎动物模型观察治疗组、美洛昔康(组阳性药组)、模型组和正常关节组血清及关节液中IL-1、IL-6、 TNFα及血清中NO、SOD的变化。(3)采用改良的Hulth法建立膝骨关节炎动物模型观察治疗组,美洛昔康组(阳性药组)、模型组和正常关节组血清及关节软骨中和滑膜中MMP-1、MMP-3mRNA表达水平的影响。(4)小鼠口服化痰除湿祛瘀剂的急性毒性试验。(5)用组织原代培养法获得膝关节软骨细胞,传代培养。通过倒置相差显微镜下观察细胞形态、绘制生长曲线、苏木素伊红染色、甲苯胺蓝染色及Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原、MMP-1、MMP-13、TNF-α免疫荧光染色对细胞进行鉴定。将软骨细胞分离传代后,取第三代细胞,分为七组(A组:软骨细胞+DMEM对照组;B组:软骨细胞+5%化痰除湿祛瘀剂血清;C:软骨细胞+5%NS血清;D组:软骨细胞+10%化痰除湿祛瘀剂血清;E组:软骨细胞+10%NS血清;F组:软骨细胞+20%化痰除湿祛瘀剂血清;G组:软骨细胞+20%NS血清;),取4h、8h、24h、48h、72h,采用RealTime-PCR法检测各型胶原和代谢酶mRNA表达。 结果:(1)模型组兔膝关节肿胀率达14.6%,治疗组药组兔膝关节肿胀率12.8%,步行能力较模型组有明显改善。模型组兔患侧膝跛行严重,关节表面变暗呈灰色,并有裂纹、糜烂及溃疡形成。滑膜存在不同程度的增生粘连,关节液量增多且呈泡沫状,浑浊,Markins评分高于假手术对照组。治疗组关节软骨及滑膜形态结构虽未恢复到正常状态,但Markins评分较模型组显著降低。(2)模型组兔血清中及关节液中IL-1、IL-6、TNFα较假性手术组显著升高,而治疗组以上情况均得到明显改善;模型组SOD活性较假性手术组降低,而N0含量显著升高,治疗组SOD活性较模型组显著升高NO无显著性差异,但也有降低趋势。(3)模型组兔关节软骨及滑膜组织中MMP-1、MMP-3mRNA的表达水平较对照组明显升高(P小于0.01),治疗组MMP-1、3在关节及滑膜中mRNA的表达水平较模型组明显降低(p小于0.05)。(4)小鼠口服化痰除湿祛瘀剂最大耐受量为234g/kg,为成人常用量的100倍以上。(5)化痰除湿祛瘀剂含药血清有上调退变膝关节原代培养的人软骨细胞大量呈梭形、短梭形,少部分呈多角形,传代3次后出现树突生长的细胞。细胞培养3代以内,多数软骨细胞能够维持梭形,细胞核多数维持圆形。在形态学、免疫荧光染色方面可保持表型的稳定,苏木精伊红阳性染色为软骨细胞基质呈红色,细胞核呈蓝紫色,胞浆及细胞周围有紫红色、阿利新蓝染色细胞浆和胞膜均呈深蓝色、II型胶原免疫荧光染色可见胞浆和胞膜为绿色荧光,细胞核区域无荧光。化痰除湿祛瘀剂含药血清均有下调退变软骨细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13、IL-1、IL-6、TNF-α的作用,其中8小时10%含药血清的下调MMP-1、MMP-3、MMP-13和IL-1作用相对较好,24小时10%含药血清的下调IL-6的作用相对较好,48小时10%含药血清的下调TNF-a的作用相对较好。(P0.05) 结论:实验成功建立了的软骨细胞分离、培养体系,且3代以内细胞生长良好。证明了化痰除湿祛瘀剂治疗膝骨性关节炎可减缓关节退变及破坏,且安全无明显毒副作用。


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