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丹酚酸B对心肌缺血大鼠血管新生及对正常大鼠离体胸主动脉环张力的影响

许波华  
【摘要】:目的:观察丹酚酸B (Salvianolic acid B,简称Sal B)体外对人脐静脉内皮细胞(HUVECS)增值、迁移和管腔形成的影响,SalB对心肌缺血大鼠血管新生的影响及作用机制;观察SalB的血管舒张作用并探索其作用机制。 方法:1.(1)取对数期生长的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECS),用MTT法观察SalB对HUVECS活力和增殖的影响;用3H掺入法检测SalB对HUVECS DNA合成率的影响;细胞划痕法检测Sal B对细胞迁移距离的影响;Transwell实验验证Sal B对细胞划痕迁移的作用;用体外毛细血管管腔结构实验检测Sal B对HUVECS管腔形成的影响;(2)将HUVECS用Sal B处理12h、24h、48h后,酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定HUVECS上清中VEGF的含量;用试剂盒测定HUVECS上清中NO和NOS的含量;将HUVECS用SalB处理24h和48h后收集细胞,Western Blot检测HUVECS中VEGF的表达;(3)结扎大鼠冠状动脉左降支建立大鼠心肌缺血模型,每组大鼠分别尾静脉注射SalB1.6、3.2和6.4mg/kg,空白组,假手术组和模型组给予同等体积的生理盐水。测定给药后血清VEGF的含量;测定心肌组织匀浆中NO、 NOS、 VEGF的含量;测定缺血心肌的梗死面积;取心脏缺血区域做组织病理学检测;通过免疫组化法测定梗死边缘区新生血管数(MVC)。 2.制备大鼠离体胸主动脉环,通过给药观察SalB对离体胸主动脉环的直接作用;(1)观察Sal B对NE收缩血管环的影响:①先加入10-6mol/L NE收缩血管,再加入不同浓度的SalB观察其对收缩血管的舒张能力;②用不同浓度的SalB对血管预处理15min再加入10-6mol/LNE收缩血管,观察最大收缩张力;③用累积加药法加入不同浓度的NE,记录不同浓度NE的收缩曲线,然后冲洗血管,待稳定后,先加入不同浓度的Sal B预处理,然后累积加入不同浓度的NE,记录其收缩曲线,观察其收缩曲线的变化;(2)观察SalB对KCl收缩血管环的影响:①先加入60mmol/L KCl收缩血管,再加入不同浓度的SalB观察其对收缩血管的舒张能力;②先用不同浓度的Sal B对血管预处理再加入60mmol/L KCl收缩血管,观察最大收缩张力;③用累积加药法加入不同浓度的KCl,记录不同浓度KCl的收缩曲线,然后冲洗血管,待稳定后,先加入不同浓度的Sal B预处理,然后累积加入不同浓度的KCl,记录其收缩曲线,观察其收缩曲线的变化;(3)观察Sal B对CaCl2收缩血管环的影响:先通过累积加入不同浓度CaCl2得到CaCl2收缩曲线,然后用不同浓度SalB预处理后再加入不同浓度CaCl2得到CaCl2收缩曲线,观察SalB对收缩曲线的变化;(4)观察Sal B对NE引起的依赖于细胞外钙和内钙的收缩反应的影响;(5)通过加入不同的抑制剂来探讨Sal B舒张血管环作用是否与内皮和钾离子通道有关;(6)通过加入β受体阻断剂来观察SalB舒血管作用是否与p受体有关。 结果:1:(1)3H掺入法,结果显示SalB在一定浓度范围内对HUVECS增殖作用明显;细胞划痕实验和Transwell结果表明Sal B对HUVECS迁移有明显的促进作用;管腔形成实验显示,SalB作用HUVECS后可以使管腔形成数增多,管腔长度增长;(2)HUVECS经SalB处理后,HUVECS上清中VEGF、 NO和NOS含量增加,VEGF表达上调;(3)Sal B可以使心肌组织中NO、NOS和VEGF含量增加,同时血清中VEGF含量也增加;Sal B能够减少心肌梗死面积,增加缺血区域和非缺血.区域的血管新生。2:直接加入SalB后发现SalB对基础状态下胸主动脉无明显的直接作用;SalB能明显抑制NE的收缩,使NE的收缩曲线右移;SalB对KCl的收缩无明显影响;SalB能使无钙高钾中CaCl2引起的收缩曲线明显右移;经无钙液处理后SalB能阻断NE诱发的外钙收缩和内钙收缩;SalB舒张血管作用与内皮、钾离子通道和β受体无关。 结论:(1)SalB在体外能促进HUVECS的增值、迁移和管腔形成,其作用机制可能与上调HUVECS中VEGF的表达有关;(2)SalB能促进心肌缺血大鼠心脏的血管新生,对缺血心肌具有保护作用;(3)SalB可呈非内皮依赖性舒张血管,其作用机制可能与阻断受体依赖性钙通道、电压依赖性钙通道引起的外钙内流和阻断三磷酸肌醇(IP3)受体引起的内钙释放有关,与血管平滑肌上钾离子通道和β受体无关。


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