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环维黄杨星D肝脏毒性机制的研究

瞿凌晨  
【摘要】:目的:观察环维黄杨星D对肝脏毒性作用并探讨其毒性作用机制。 方法:1、MTT法观察不同剂量CVB-D作用不同时间对L-02细胞活力的影响;倒置显微镜下观察CVB-D对细胞整体形态的影响;检测CVB-D作用后L-02上清中LDH、SOD、MDA含量和细胞内GSH含量、ATPase活力;流式细胞仪检测CVB-D对细胞凋亡与周期的影响;Hoechst染色法观察CVB-D对L-02细胞细胞核形态的影响;测定不同浓度CVB-D作用L-02细胞后线粒体膜电位和细胞内Ca2+浓度的变化。2、大鼠随机分为正常对照组,CVB-D大、中、小剂量组,给药组灌胃给予CVB-D3、6、12mg-kg-1,对照组给予同等体积的溶媒溶液。连续给药八周,观察大鼠的一般情况及体重变化,并于第4周和第8周分别检测血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、胆红素(TBIL)和碱性磷酸激酶(ALP)含量;观察大鼠肝脏系数及组织病理变化。3、检测大鼠血清中和肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)的含量,检测肝组织匀浆中谷胱甘肽(GSH)、ATPase的活力;基因芯片检测大鼠给予CVB-D12mg·kg-18周与对照组大鼠肝脏基因表达的差异;RT-PCR检测肝组织中Na+,K+-ATPase、Ca2+,Mg2+-ATPase、 Ca2+-ATPase、Bax和Bcl-2的mRNA表达水平。 结果:1、CVB-D可显著抑制L-02细胞的增殖并呈时间和剂量依赖性,且加入CVB-D后,细胞形态呈现变圆、收缩,脱壁等改变,细胞LDH的释放增加并呈剂量依赖性(P0.05,P0.01); AnnexinV/PI染色显示给药组L-02细胞出现凋亡和坏死现象,并有明显的染色质凝聚,细胞核染色同时显示出凋亡特征,CVB-D10μM和20μM使L-02细胞G2/M期增加和S期减少;经CVB-D处理细胞中SOD、MDA和GSH含量与对照组比较无明显变化,Na+,K+-ATPase、Ca2+,Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase活力明显下降(P0.05,P0.01);激光共聚焦结果显示,经CVB-D处理的细胞胞内游离Ca2+浓度显著升高,细胞线粒体膜电位下降,并且呈浓度依赖性。2、CVB-D连续灌胃4、8周后,雌性大鼠肝脏系数明显增加(P0.01); CVB-D3mg·kg-1组大鼠血清中ALT含量明显增加(P0.05), CVB-D6mg·kg-1组大鼠血清中AST和ALP含量明显增加(P0.05, P0.01), CVB-D12mg·kg-1组大鼠血清中ALT、AST、TBIL和ALP含量明显增加(P0.05,P0.01);组织病理学观察显示CVB-D能对大鼠肝脏造成毒性损伤;基因芯片结果显示CVB-D可能影响MAPK信号转导通路,其中FGF、Ras、IL-1、TNF、p53基因上调,凋亡通路中CytC、Apaf-1、Bax、AIF基因上调,细胞周期中CDK1、CycA、APC/C、PTTG基因下调,p53信号转导通路的p21、Cyclin D、Cdc2、BAI-1、p53R2基因下调。3、CVB-D大鼠血清中SOD、MDA无明显影响,对大鼠肝组织匀浆中SOD、MDA、GSH也无影响,但是肝脏组织中ATPase活性降低;RT-PCR结果显示:CVB-D灌胃8周后能使大鼠肝脏中Ca2+-ATPase, Ca2+,Mg2+-ATPase, Na+,K+-ATPase mRNA表达水平明显下调(P0.01); Bax mRNA表达明显上调,Bcl-2mRNA表达水平下调。 结论:1、CVB-D能明显抑制L-02细胞活性,作用机制可能为CVB-D抑制Ca2+-ATPase,Ca2+,Mg2+-ATPase, Na+,K+-ATPase舌性,引起细胞内钙离子超载,导致L-02细胞凋亡和坏死,与氧化损伤无关。 2、CVB-D长时间大剂量口服给药对大鼠有明显肝毒性作用,基因心芯片结果显示,CVB-D影响肝脏代谢路径、细胞周期、细胞凋亡、钙离子结合等途径,这些基因的改变可能对肝脏造成损伤。


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