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山茱萸—熟地黄药对与肠道菌群的相互作用研究

赵敏  
【摘要】:慢性肾炎是由众多病因诱发的一种常见肾小球疾病,其发病率正逐年增加。慢性肾炎的发展隐匿且速度较慢,但最终可导致肾功能的慢性衰竭,同时伴随高血压、血尿、蛋白尿、肾功能损坏等临床症状,是造成患者死亡的首要原因之一。传统中药用于临床治疗已有数千年的历史,山茱萸-熟地黄药对出自《金匮要略》,是治疗肾病的常用药对。山茱萸主要活性成分是马钱苷和莫诺苷,而熟地黄主要活性成分则是梓醇和毛蕊花糖苷。传统中药通常采用用口服的方式给药,中药活性成分在肠道内与肠道微生物接触的过程中,由于肠道菌群可产生多种代谢药物的酶类,从而可能引起活性化合物的生物利用度及其药理活性的改变。本文研究了肠道菌群与山茱萸-熟地黄药对的体外相互作用以及该药对在大鼠的体内过程,以探讨活性成分在机体内的变化规律,为临床用药提供科学依据。1山茱萸-熟地黄药对与人肠道细菌的相互作用研究依照《伯杰细菌鉴定手册》(第八版),采用菌落形态、显微形态等微生物学方法,并结合16s rRNA分析的分子生物学技术,从健康人的粪便中分离并鉴定了Escherichia、 Enterococcu和Bacillus属约100种肠道细菌,将山茱萸、熟地黄的主要活性成分单体、单煎液与合煎液分别与分离得到的肠道细菌恒温厌氧培养,采用UPLC-QTOF/MS技术寻找和鉴定孵育样品中的代谢产物。此外,考察了山茱萸、熟地黄及其药对提取液对4种代表性肠道细菌双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌和肠球菌等的调控作用。与空白样品UPLC/MS图谱对比分析肠道细菌的代谢情况,结果表明:人肠道细菌对山茱萸、熟地黄中的活性成分具有去糖基、氢化、羟基化、甲基化、乙酰化等生物转化能力。对于马钱苷、莫诺苷和梓醇,约56%肠道细菌具有脱葡萄糖基的功能,去糖基反应是肠道细菌的主要代谢途径,去糖基后,一些肠道细菌可对苷元进一步转化。对于毛蕊花糖苷,去咖啡酰基是肠道细菌的主要代谢途径,约55%人肠道菌具有此功能。单一菌株与混合菌群相比,转化能力较强;中药配伍使用,转化液中的活性成分及其肠道细菌代谢物含量降低。山茱萸、熟地黄提取物对4种代表性人肠道细菌的调控实验表明,山茱萸、熟地黄单煎液与合煎液均促进有益菌双歧杆菌和乳酸杆菌的生长,而对有害菌肠杆菌和肠球菌的生长具有抑制作用;与单煎液相比,合煎液对肠道菌群的调控作用更加显著。2山茱萸-熟地黄药对的大鼠肠道细菌代谢研究采用单次尾静脉注射阿霉素的方法成功复制了慢性肾炎的模型大鼠后,将山茱萸、熟地黄单煎液与合煎液分别与正常和模型大鼠的肠道菌液共同恒温厌氧培养,采用UPLC-QTOF/MS技术寻找和鉴定可能的代谢产物。山茱萸的大鼠肠道菌群代谢物主要包括马钱素、氢化马钱素、去甲基氢化马钱素、去甲基莫诺苷苷元、去羟基莫诺苷苷元。熟地黄的代谢产物主要有梓醇苷元、氢化梓醇苷元、去咖啡酰基毛蕊花糖苷、咖啡酸、甲基咖啡酸、羟基酪酸。与正常大鼠相比,模型大鼠肠道菌群代谢途径类似,但各种代谢产物的含量较低,原型化合物含量较高。此外,去葡萄糖基和去咖啡酰基作用分别是环烯醚萜苷与毛蕊花糖苷的肠道菌群主要代谢途径。3山茱萸-熟地黄药对的体内过程研究采用UPLC-MS技术,同时检测马钱苷、莫诺苷、梓醇和毛蕊花糖苷在正常与慢性肾炎模型大鼠体内的动态含量,同时分析了大鼠血浆、尿液和粪便中主要活性成分及其代谢物。并采用Caco-2细胞模型考察了山茱萸-熟地黄的人肠道菌群代谢物的跨膜能力。药代动力学结果表明,单味药配伍后,各活性成分的t1/2、AUC0→t、AUC0-∞增大,CLz/F降低;与正常大鼠相比,在模型大鼠体内AUCo-t、AUC0-∞、Cmax增大,CLz/F降低,提示原成分的生物利用度增加、药效延长。检测大鼠体内代谢物显示:活性成分在大鼠体内可发生硫酸结合、葡萄糖醛酸结合、甲基化和氢化等反应。配伍以后体内可能的代谢产物种类和含量均降低。病理条件下,原型化合物含量增加,代谢产物含量减少。Caco-2细胞实验表明,山茱萸的肠道菌群代谢物马钱素、氢化马钱素、去羟基莫诺苷苷元可透过细胞膜,熟地黄可透膜的肠道菌群代谢物主要包括氢化梓醇苷元、咖啡酸、甲基咖啡酸、羟基酪酸。药对可透膜的代谢物种类与单味药相似,但代谢物含量较低。综上所述,山茱萸、熟地黄的肠道菌群代谢与其治疗慢性肾炎的功能密切相关。一方面,肠道菌群代谢活性成分影响药物的吸收;另一方面,药物提取液口服后可促进肠道中有益菌的生长并抑制有害菌的生长,从而降低机体内炎症因子含量,减轻慢性肾炎患者炎症症状。本研究为山茱萸-熟地黄药对药效物质基础、体内吸收、微生物代谢机制、生物利用度等相关研究奠定了重要基础,为临床合理用药提供了重要依据,并有助于治疗慢性肾炎新药的开发。


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