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基于酶解技术的四角蛤蜊多肽及活性研究

朱蕴菡  
【摘要】:本论文是国家海洋局海洋公益性行业科研专项“四角蛤蜊深加工功能性保健品的研究开发”(编号:200705009)的延伸。受到国家海洋公益性行业科研专项“江苏沿海低值贝类全值化综合利用关键技术开发与规模化示范”(编号:201305007)及江苏高校优势学科建设工程资助项目(编号:ysxk-2010)的资助。本论文基于传统中医药理论及张兆旺教授“半仿生提取法”的理念,以人体消化环境中两种常见的消化酶,胃蛋白酶和胰蛋白酶模拟体内酶解过程对四角蛤蜊软体进行酶解,研究四角蛤蜊酶解物的生物活性。获得的酶解物具有良好的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性和一定的羟自由基清除能力,采用响应面法优化酶解工艺,超滤获得酶解物不同分子量段并以体外ACE抑制活性评价酶解物活性部位,以UPLC-Q-TOF MS研究酶解物活性部位物质基础,通过计算机分子对接技术辅助筛选获得ACE抑制活性肽,进一步通过固相合成方法制备活性肽,验证多肽的结构与ACE抑制活性。本论文提出一种快速筛选、准确寻找及评价四角蛤蜊酶解物中活性多肽的研究思路与方法。通过本论文的研究,旨在为江苏沿海低值贝类软体中酶解活性多肽乃至海洋生物活性肽的寻找与评价提供依据,并为进一步开发低值贝类功能保健产品奠定实验基础。主要内容包括以下几个部分:一.文献研究通过查阅活性肽物质结构(或氨基酸序列)与功效相关性的研究文献,分析整理并概述了血管紧张素转化酶抑制肽、抗氧化肽和抗菌肽构效关系的研究进展;通过查阅国内外分子对接的研究报告,对分子对接的研究进展进行了文献研究、整理和概述。二.四角蛤蜊酶解活性产物的制备研究1.以四角蛤蜊经水煎煮后的肉渣为原料,采用2种常见的消化道蛋白酶(胰蛋白酶和胃蛋白酶)在适宜条件下进行酶解,同时对所得的酶解物进行ACE抑制活性和抗氧化活性的比较研究,研究结果表明以胰蛋白酶进行酶解的酶解产物具有良好的ACE抑制活性和一定的抗氧化活性。2.以胰蛋白酶作为酶解介质,通过温度、pH、加酶量、时间的单因素试验,以ACE抑制率为响应值,使用中心点对称的响应面设计进一步优化酶解工艺,确定了以四角蛤蜊肉渣为原料,以胰蛋白酶作为酶解介质,制备具有ACE抑制活性酶解产物的最佳工艺条件:pH为8.5,温度48℃,时间2 h,酶-底物比为0.6%。3.分别选用截留分子量为1k Da、3k Da和5k Da的超滤膜,对四角蛤蜊酶解物进行分离,并比较不同分子质量段的ACE抑制活性。结果表明,分子质量1k Da和I~3k Da部位的活性较强,抑制率分别达83.39%和80.20%,称为四角蛤蜊活性酶解物。4.考察了四角蛤蜊活性酶解物的热稳定性、酸碱稳定性和对消化道酶的耐受力,结果表明四角蛤蜊活性酶解物具有较好的稳定性。三.四角蛤蜊活性酶解物效应物质基础的研究1.采用UPLC-Q-TOF MS对分子质量1k Da的四角蛤蜊活性酶解物进行分析,发现了5个主要的多肽,进一步通过LC-MS/MS分析及从头测序(de novo sequencing)计算,获得18种可能的氨基酸序列信息。2.以18种氨基酸序列的多肽为配体,ACE为受体建立分子对接模型,采用分子对接技术,用Discovery Studio软件进行分子对接研究,筛选确定具有ACE抑制活性的多肽序列为LL与LASPTM.3.进一步采用固相合成的方法制备获得活性肽LL与LASPTM, LC-MS/MS技术确认分子量及氨基酸序列,体外ACE抑制实验验证其生物活性,结果表明合成的多肽与分子质量1k Da的四角蛤蜊活性酶解物中活性多肽氨基酸序列一致,确证氨基酸序列的准确性,ACE抑制活性与分子对接筛选实验结果一致,确证分子对接研究的准确性与可行性。


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