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四角蛤蜊多糖酸水解产物抗氧化及保肝活性研究

刘新  
【摘要】:本课题来源于国家海洋局公益性行业科研专项基金项目(No.201305007),以及国家自然科学基金-青年科学基金项目(No.30900293)。本论文的研究对象是江苏海域优势生长的海洋贝类软体四角蛤蜊,四角蛤蜊软体采用水煎煮醇沉提取工艺获得四角蛤蜊多糖。论文对课题组前期研究的水煎煮醇沉得到的四角蛤蜊多糖进行进一步分离纯化,获得含量为90%左右的四角蛤蜊精制多糖,研究了其抗氧化性能;进一步采用酸水解的方法得到四角蛤蜊多糖酸水解产物。优化了酸水解的工艺,得到最佳的工艺条件,然后分析了酸水解产物的组成,研究了酸水解产物的体外抗氧化活性,细胞水平及整体动物水平的保肝活性。支撑本论文的主要研究内容包括以下几个部分:1.四角蛤蜊多糖抗氧化性研究采用三氯乙酸(TCA)法对得到的粗多糖进行除蛋白处理,进一步采用透析法除去杂质,沉淀干燥后,得到总糖含量为90%以上的精多糖,其中还含有少量的蛋白质;通过比色法测定不同浓度的四角蛤蜊多糖溶液对羟自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)的清除能力,以及采用普鲁士蓝反应法测定其还原能力;结果表明,随着多糖浓度的增加,其对于羟自由基及DPPH自由基的清除能力增强,还原能力也有所提高。2.四角蛤蜊多糖酸水解工艺研究及产物分析(1)本实验首先研究了水解四角蛤蜊多糖所用酸的种类,包括盐酸、硫酸、三氟乙酸;三种酸均在浓度1 mol/L条件下对四角蛤蜊多糖进行水解,水解时间2h后制得了相应的水解产物,分别考察水解产物的羟自由基清除率、DPPH清除率以及还原能力,以确定水解所用酸的种类。结果表明,盐酸和三氟乙酸酸水解产物的羟自由基清除能力、DPPH自由基清除能力以及还原能力相当,且都比硫酸酸水解产物的抗氧化能力强。(2)进行了四角蛤蜊多糖酸水解产物的分析,本实验采用了HPLC-ELSD检测三种酸酸水解产物的组成及相对含量,并采用LC-MS确定产物的组成。色谱结果显示,盐酸和三氟乙酸酸水解产物组成和各个组分相对含量相似,硫酸水解能力比前两者强,得到的寡糖较少,几乎都水解成葡萄糖。质谱结果显示,酸水解产物主要由葡萄糖,葡聚二糖、三糖、四糖及五糖等寡糖组成。(3)进行了四角蛤蜊多糖盐酸水解单因素考察,本实验研究了四角蛤蜊多糖的酸水解工艺,主要从以下三个因素进行考察,包括酸水解的时间、酸的浓度以及酸水解时的温度,以羟自由基清除率为考察指标,最终确定盐酸水解四角蛤蜊多糖的最佳条件为1 mol/L的盐酸在80℃时水解2h。3.四角蛤蜊多糖酸水解产物在细胞水平上对肝脏的保护作用(1)采用MTS法测定不同浓度四角蛤蜊多糖酸水解产物对人正常肝细胞株L-02相对增殖率的影响;结果显示,四角蛤蜊多糖酸水解产物终浓度在0~5000μg/mL作用24小时内对L-02人肝细胞没有显者增殖抑制作用,但随看浓度的增加,开始对细胞增殖表现出促进作用,故选择对细胞的增殖无显著影响的浓度(20-320μg/mL)作为后期细胞实验的浓度范围。(2)考察四角蛤蜊多糖酸水解产物对过氧化氢及乙醇损伤人肝细胞的保护作用,人肝细胞L-02经不同剂量和不同时间孵育于过氧化氢与乙醇中,确定过氧化氢及乙醇对肝细胞损伤敏感的孵育时间与剂量。孵育前用四角蛤蜊多糖酸水解产物进行不同作用时间的预作用,确定样品的预作用时间。检测细胞培养上清液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶活力及肝细胞的氧化一抗氧化指标丙二醛、超氧化物歧化酶来观察四角蛤蜊多糖酸水解产物对肝细胞受过氧化氢及乙醇氧化损伤的保护效应。结果显示,过氧化氢的孵育浓度为2 mmol/L,孵育时间为8 h,乙醇的孵育浓度为100 mmol/L,孵育时间为8 h;四角蛤蜊多糖酸水解产物预作用时间为1h;随着四角蛤蜊多糖酸水解产物浓度的增加,对于各个指标的改善作用增强。4.四角蛤蜊多糖酸水解产物在整体动物水平上对肝脏的保护作用考察四角蛤蜊多糖酸水解产物对四氯化碳及乙醇所致小鼠急性肝损伤的保护作用,采用四氯化碳及乙醇诱导小鼠急性肝损伤,动物脱颈椎处死后取血清测定其中谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性,取肝脏计算肝脏指数并制备肝匀浆测定其中超氧化物歧化酶活力、丙二醛含量,对数据做统计分析,并对小鼠肝脏进行组织切片观察。结果显示,中、高剂量的酸水解产物均能极显著抑制CCl4及乙醇急性肝损伤所引起的MDA含量、肝脏指数、ALT和AST活性的升高,有效地抑制肝脏中SOD活性的降低,能减轻小鼠的肝组织损伤程度。结论:四角蛤蜊多糖酸水解产物对CCl4及乙醇诱导的小鼠急性肝损伤有较好的保护作用。


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