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荆三棱抗炎部位和有效成分SsnB对脑出血炎症损伤的保护及SsnB衍生物构效关系与分子对接研究

刘杰  
【摘要】:荆三棱(Scirpus yagara Ohwi=S fluviatilis(Torr.)A.Gray)的干燥块茎是常用的活血化癖药,具有破血行气、消积止痛的功能,在临床上治疗产后腹痛、经闭以及炎性担关疾病[9~(-1)0]。近年来,国内外学者从荆三棱块茎中分离得到大量的化学成分,结构涉及芪类、三萜类、黄酮类、酚酸类化合物。药理学表明这些化合物有抗氧化、抗病毒、抗炎的作用。前期通过体外细胞实验从荆三棱提取物中筛选出了具有显著抗炎活性的有效部位(AF),并通过高效液相色谱法分析测定了 AF中8个主要化学成分;进一步的研究发现,AF能显著降低由LPS诱导的RAW 264.7炎症反应产生的TNF-α和IL-6的表达水平,提高由LPS诱导引发的脓毒性休克小鼠的死亡率。另外,还从AF中分离得到一些文献尚未报道的化合物,如Sprstolonin B(SsnB),SsnB是一个选择性的TLR2和TLR_4的拮抗剂,能与细胞膜上的TLR2、TLR_4的TIR结构域或TIRAP/Mal蛋白结合,阻断TLR2和TLR_4招募下游信号接头蛋白MyD88,使TLR2和TLR_4信号通路级联反应中断,从而使细胞中TNF-α、IL-6等细胞因子产生减少而表现出强抗炎活性。脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是急性脑血管病的主要病种之一,发病率、死亡率和致残率极高,全世界每年约有3百万ICH新发病人。近20年,亚洲ICH中风占每年中风新发病人20-30%。ICH发生时,血液中的成分包括红细胞、白细胞、巨噬细胞、血红素等各种血浆蛋白会立即进入脑实质,随即使脑实质中小胶质细胞和星形胶质细胞等累积并激活,引发炎症反应;其中凝血酶与蛋白酶活化受体(PAR)结合而激活小胶质细胞,使小胶质细胞释放各种细胞因子、趋化因子、自由基等引起炎症反应;纤维蛋白原则通过与TLR_4结合激活小胶质细胞,引起炎症信号级联反应,产生大量炎性因子损伤脑组织。因此,本文研究了荆三棱中具有抗炎活性的有效部位AF及单体化合物SsnB对脑出血老鼠继发性炎症损伤的保护作用,并初步研究了其作用机制。在AF保护ICH诱导的小鼠脑损伤实验中,从小鼠尾动脉取25 自体血直接注入纹状体,造成实验性脑出血模型;于造模后的第1d、第3d和第5 d对脑出血小鼠进行神经功能缺损评分(neurological deficit score,NDS),于第3d测定脑组织含水量;应用ELISA法检测ICH小鼠第1 d、第3 d和第5 d脑组织匀浆中炎性细胞因子IL-6、IL~(-1)β和TNF-α的含量变化。结果显示300 mg·kg~(-1)和600 mg·kg~(-1)AF都能显著减少ICH小鼠的NDS,降低ICH小鼠血肿同侧脑组织水肿的含量;在第1 d和第3 d明显下调脑血肿周围组织中炎性细胞因子的含量。结论:AF对ICH小鼠脑损伤有保护作用,其可能机制是通过下调ICH小鼠脑组织炎性因子水平起作用。在SsnB保护ICH诱导的大鼠脑损伤实验中,通过体外Transwell实验观察了 SsnB对血红蛋白(hemoglobin,Hb)诱导的小胶质细胞损伤神经元的影响;采用自体血注射脑出血模型,出血后的第1、3、5、7 d观察SsnB对ICH大鼠神经功能缺损评分(neurological deficit score,NDS),脑组织含水量的影响,ELISA法检测ICH大鼠脑组织匀浆中炎性细胞因子IL-6、IL~(-1)β和TNF-α的含量变化。结果显示第1、3 d,5 mg·kg—1和15 mg·kg—1 SsnB都能减少ICH大鼠的NDS,降低ICH大鼠脑组织含水量,明显下调脑血肿周围组织中炎性细胞因子的含量。结论:SsnB对ICH大鼠脑损伤有保护作用,其机制可能与SsnB保护受损神经元,减轻脑出血大鼠神经功能缺损,降低脑组织含水量和炎症因子有关。为了获得具有更好抗炎活性的化合物,对SsnB进行了结构修饰,合成一系列SsnB衍生物,并通过体外实验研究了这些化合物的脂水分配系数及其对LPS或Pam3csk4诱导的巨噬细胞炎症反应的抗炎活性,构建了相关性显著,预测能力强的比较分子力场分析CoMFA及比较分子相似性指数分析CoMSIA模型;同时,以这些化合物为配体,研究了他们与TLR_4的分子对接情况。根据对CoMFA模型及CoMSIA模型三维等势图的分析,解释了化合物结构和活性之间的关系,显示8,5'位羟基的存在对SsnB的抗炎活性影响明显,2位内酯环的开环及异喹啉酮化能提高化合物活性;对不同场对分子活性影响分析,显示氢键供体场(D)对分子活性的影响最大。分子对接的结果阐明了 SsnB与TLR_4的作用机制,显示碱水解和异喹啉酮化与TLR_4结合得更好,产生的抗炎活性更强。以上研究均可为后续的SsnB类化合物的设计和改造提供理论依据,以获得具有更好抗炎活性的化合物。


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