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基于调控TGF-β1/Smad信号途径的益肾化瘀方干预肾间质纤维化研究

张琳琪  
【摘要】:目的1.通过建立UUO模型和TGF-β1诱导的NRK52E转分化细胞,阐释TGF-β1/Smad途径信号蛋白的激活和相关细胞因子表达变化与TEMT发生过程及肾间质纤维化的关联性。2.益肾化瘀方通过抑制上皮细胞转分化及调控TGF-β1/Smad信号蛋白异常活化对RIF的干预效应,探究益肾化瘀方拮抗RIF的作用靶点以及可能的分子机制。方法1.采用单侧输尿管结扎法建立大鼠肾间质纤维化(UUO)模型,随机分为假手术组、模型组、益肾化瘀方高剂量组、益肾化瘀方中剂量组、益肾化瘀方低剂量组、AngⅡ受体拮抗剂缬沙坦组共6组。于UUO模型术后7d、14d、28d处死大鼠,动态观察益肾化瘀方对UUO大鼠肾功能和肾组织病理形态学的影响,采用免疫组织化学法检测益肾化瘀方对转分化标志蛋白α-SMA和E-cadherin表达的影响,以及对TGF-β1、Smad7信号蛋白表达的调控作用。2.利用体外培养的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)为研究对象,选择目前公认的致纤维化强效因子TGF-β1为刺激因子,观察NRK52E的细胞形态改变和益肾化瘀方含药血清对其修复作用,采用细胞免疫组化法观察不同浓度的益肾化瘀方含药血清,对肾小管上皮细胞转分化过程中TGF-β1/Smad途径信号蛋白p-Smad2/3、Smad7表达的影响,并试图从基因水平观察该方对TGF-β1mRNA、BMP7mRNA表达的调控效应。结果1.益肾化瘀方对UUO大鼠肾间质纤维化影响及对TGF-β1/Smad信号途径的干预研究(1)造模后7d各组大鼠肾功能即明显受损,并随梗阻时间的延长血清BUN、Scr水平逐渐升高,提示UUO造模成功。治疗后益肾化瘀方各剂量组和缬沙坦组大鼠BUN、Scr水平均较模型组有明显下降(P0.01或P0.05),益肾化瘀方高剂量组与缬沙坦组疗效相当。其中14d时益肾化瘀方各剂量组Scr水平下降最为显著,与模型组比较具有显著统计学差异(P0.01)。提示在早、中期中医药治疗效好。(2)实验结果显示益肾化瘀方可以不同程度地减轻UUO大鼠肾组织病理损伤,使肾间质炎细胞浸润减少,肾小管扩张或萎缩少见,治疗组各时间点肾间质损伤程度与模型组相比均有明显减轻(P0.01);其中14d时益肾化瘀方高剂量组对肾间质损伤修复作用最著,与同期缬沙坦组疗效相当。(3)免疫组化结果显示,模型组大鼠梗阻后7d肾组织中肌成纤维细胞表型标志蛋白α-SMA呈强阳性表达,而上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达则减少。提示在肾间质纤维化的早期肌成纤维细胞开始在间质增多,TEMT已经开始发生。益肾化瘀方可以明显抑制α-SMA的表达,其高剂量组和缬沙坦组肾组织中E-cadherin表达有明显增强。α-SMA表达的OD值显示,各治疗组在各时间点α-SMA的表达较模型组均有减少(P0.01或P0.05),而E-cadheri的表达显著增强。(4)免疫组化结果显示,造模后7d模型组大鼠肾组织中即出现TGF-β1的阳性表达,并随着梗阻时间的延长在肾小管上皮细胞胞浆呈持续丛集性的高表达,而Smad7的表达则减少。益肾化瘀方可以抑制大鼠肾组织中TGF-β1的早期高表达,提高Smad7表达的活性,在各个观测点均明显优于模型组(P0.01或P0.05)。益肾化瘀方高剂量组和缬沙坦组Smad7在肾间质的阳性表达升高最著,TGF-β1蛋白的阳性表达逐渐减弱,两者疗效相当。2.益肾化瘀方调控TGF-β1/Smad信号途径干预NRK52E转分化机制研究(1)实验发现给予10ng/mlTGF-β1浓度刺激NRK52E细胞48h后,肾小管上皮细胞形态发生改变,拉长增大呈梭形,细胞间隙增宽,具有纤维样特征。而与益肾化瘀方含药血清共同作用后,细胞形态随着含药血清浓度的增加在一定程度上有所修复,细胞间隙变窄,细胞形态渐趋向于正常。(2)细胞免疫组化结果显示,益肾化瘀方含药血清与TGF-β1共同作用NRK52E细胞48h,可不同程度地下调p-Smad2/3的表达和核转位,同时上调Smad7的表达,且这种效应呈剂量依赖性。双变量相关分析结果显示,p-Smad2/3的表达与Smad7的表达呈显著负相关,相关系数为r=-0.809,P0.01。(3)RT-PCR结果显示,经TGF-β1诱导刺激NRK52E细胞48h,细胞胞浆中的BMP-7mRNA表达下降,而外源性TGF-β1mRNA表达则上调。而与益肾化瘀方含药血清共同作用后,BMP-7mRNA表达明显上升,而外源性TGF-β1mRNA表达则显著下降,并具有剂量依赖性。与缬沙坦含药血清对BMP-7和TGF-β1的相互调控具有一致性。反映出BMP-7对TGF-β1致纤维化效应具有拮抗作用。结论1.益肾化瘀方能在一定程度上改善UUO大鼠的一般状态,降低大鼠的肾重指数,减轻UUO大鼠肾组织病理损伤,降低肾间质损伤程度。并且能够降低UUO大鼠血清BUN、Scr水平。证实益肾化瘀方具有明显的改善肾功能,延缓肾间间质纤维化的作用。2.益肾化瘀方通过下调肾组织中α-SMA的表达,上调E-cadherin表达水平,抑制大鼠肾组织中TGF-β1的早期高表达,上调Smad7的活性,而体现出抑制肾小管上皮细胞转分化效应和调控TGF-β1/Smad7信号蛋白的作用。3.益肾化瘀方含药血清对TGF-β1刺激的NRK52E细胞具有修复作用,同时在基因水平下调内源性TGF-β1mRNA的表达,上调阻抑纤维化因子BMP-7mRNA的表达。并在Smad途径通过下调p-Smad2/3的表达和核转位,上调Smad7的表达,而调控TGFβ1/Smad途径信号蛋白的激活和表达。且这种效应呈剂量依赖性。总之,益肾化瘀方对UUO大鼠具有一定的肾保护作用,可以延缓肾间质纤维化的进程。其调控机制可能与减轻肾组织病理损伤、抑制转分化标志蛋白α-SMA的表达、上调上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达密切相关,并在肾组织跨膜信号途径调控TGFβ1/Smad信号蛋白的表达和异常活化。同时通过对TGF-β1诱导的NRK52E转分化过程的阻抑作用,在基因和蛋白水平上调Smad7、BMP-7mRNA表达,抑制外源性TGF-β1mRNA的高表达和p-Smad2/3的活性,而体现出桔抗TGF-β1的致纤维化效应和阻抑上皮细胞转分化作用。体现出在组织和细胞水平对TEMT过程和RIF的阻抑作用,此为益肾化瘀方的临床应用提供了科学的理论依据和新的思路借鉴。


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