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黄芪保心汤改善扩张型心肌病大鼠心室重构及抑制内质网应激凋亡的研究

卢磊  
【摘要】:背景扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)是最常见的原发性心肌病,具有预后差,病死率高的特点,且发病逐年增长,严重威胁人类的健康。心室重构(Ventricular remodeling,VR)是引起DCM心力衰竭的主要病理基础,而抑制或逆转心室重构是DCM治疗的关键。心室重构机制复杂,与神经-体液调节、细胞凋亡、炎症因子等因素密切相关。细胞凋亡是心脏重构最重要的机制之一。它与心力衰竭的发生发展密切相关,抑制心肌细胞凋亡可以减轻心脏重构,改善心功能。近年来,在经典的线粒体途径和死亡受体凋亡途径以外,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)通路的发现,为细胞凋亡提供了新的信号途径。研究认为通过抑制过度的ERS反应,可以减轻心肌细胞凋亡,并因此达到改善和逆转心室重构的目的。中医药对DCM有丰富的理论研究和治疗经验,具有多途径、多环节、多靶点、安全有效的治疗特点,为DCM的现代治疗提供新的方向。黄芪保心汤是张培影教授根据中医基础理论,结合多年临床经验研发的经验方,临床应用多年疗效显著。前期临床研究表明其可改善DCM患者心功能及预后,抑制患者心肌纤维化,并通过初步基础实验验证其抗心肌纤维化的作用机制。鉴于前期的临床及基础工作,设想黄芪保心汤能抑制神经内分泌系统激活,逆转DCM心室重构的发生,且其分子作用机制可能与其抑制ERS介导心肌细胞凋亡相关。因此本研究采用阿霉素造模建立DCM大鼠模型,探索黄芪保心汤抑制神经内分泌因子、改善DCM大鼠心室重构的作用,并从ERS介导的细胞凋亡途径入手,探讨黄芪保心汤改善DCM大鼠心室重构的分子机制。同时采用血清药理学和血清药理化学的方法,以大鼠为含药血清的供体,以体外原代培养的乳鼠心肌细胞作为研究的对象,通过给予血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导,建立心肌细胞凋亡模型,研究黄芪保心汤含药血清对AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡及ERS相关凋亡蛋白的影响,从细胞层面探讨黄芪保心汤通过抑制ERS介导细胞凋亡达到抑制心室重构的分子机制。本研究分为以下四个部分:实验一:黄芪保心汤改善DCM大鼠心室重构作用的研究目的:验证黄芪保心汤抑制RAAS系统激活,改善DCM大鼠心室重构的作用方法:通过对90只SD大鼠腹腔注射阿霉素(2.5 mg/kg,每周1次,共8次)建立DCM模型,彩超验证后成模共计55只,随机分组给药如下:模型组(等量无菌水)、黄芪保心汤低、中、高剂量组(分别予5.67g、11.34g、22.68g生药/kg),卡托普利组(6.75 mg/kg),每组11只,每天灌胃给药1次,连续4周。另设正常对照组大鼠10只(等量无菌水灌胃)。4周后,超声心动图检测左室结构及功能变化;颈动脉插管检测血流动力学指标;观察心脏大体形态并称重测心重指数;通过HE染色、Masoon染色观察心肌组织形态学改变;ELISA法检测血清N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)、基质裂解素2(ST2)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、醛固酮(ALD)、肾素活性(Renin)水平;考马斯亮兰法测定心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性,脂质过氧化物丙二醛(MDA)和乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果:与正常组比较,模型组大鼠LVEDD、LVESD增高,EF、FS及SV值降低(P0.01);LVDP、±dp/dtmax减低,LVEDP升高(P0.01);心脏形态变大,心重指数增大(P0.01);心肌细胞排列紊乱,大量纤维组织增生;血NT-proBNP、ST2、Renin、AngⅡ、ALD水平均升高(P0.01);SOD水平降低,MDA、LDH升高(P0.01)。与模型组比较,黄芪保心汤低、中、高剂量组可不同程度地降低大鼠LVEDD、LVESD,升高 EF、FS、SV 值(P0.05,P0.01);升高 LVDP、±dp/dtmax,降低 LVEDP(P0.05,P0.01);降低HWI和LVMI(P0.05,P0.01);心肌细胞排列整齐,纤维组织增生减轻;使血 NT-proBNP、ST2、Renin、AngⅡ、ALD 水平不同程度下降(P0.05,P0.01);降低MDA和LDH,并升高SOD水平(P0.05,P0.01)。低、中、高剂量组呈一定的剂量-效应关系,高剂量组最优,结果与阳性药物组比较无统计学差异(P0.05)。结论:黄芪保心汤可改善扩张型心肌病大鼠心脏扩大、纤维化增生及心功能,通过调控氧化因子、抑制RAAS系统神经内分泌因子激活,改善心功能,抑制心室重构。实验二:黄芪保心汤抑制DCM大鼠内质网应激细胞凋亡机制的研究目的:验证黄芪保心汤抑制DCM大鼠内质网应激细胞凋亡的作用机制。方法:本研究采用实验一中保存的各组组织标本,通过TUNEL染色,检测组织心肌细胞的凋亡水平,予免疫组化法和Western blotting法,检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3的蛋白表达水平,并予Western blotting检测ERS分子伴侣GRP78及下游CHOP、Caspase-12凋亡通道蛋白表达水平。结果:与正常组比较,模型组心肌细胞凋亡水平明显增加(P0.01);组织中促凋亡因子Bax和Caspase-3的蛋白表达增加,而抗凋亡因子Bcl-2降低(P0.05);而心肌组织中GRP78、Caspase-12和CHOP的蛋白表达水平增加(P0.05)。与模型组比较,低、中、高剂量组黄芪保心汤可不同程度地降低心肌细胞凋亡水平(P0.05.,P0.01);但低剂量组对凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase-3无明显改善(P0.05),中、高剂量组可明显降低促凋亡因子Bax和Caspase-3的蛋白表达水平,升高抗凋亡因子Bcl-2的表达水平(P0.05);低剂量组对心肌组织中的GRP78、Caspase-12和CHOP的蛋白表达水平无明显改善(P0.05),中、高剂量组可不同程度降低心肌组织中ERS分子伴侣GRP78和Caspase-12、CHOP凋亡通道蛋白的表达(P0.05),各剂量组结果呈一定的剂量-效应关系,高剂量组最优,结果与阳性药物组比较无统计学差异(P0.05)。结论:阿霉素诱导DCM模型大鼠中存在ERS介导细胞凋亡的发生,而黄芪保心汤可能通过抑制ERS,降低分子伴侣GRP78的蛋白表达,抑制下游的Caspase-12和CHOP凋亡通路蛋白表达,而上调Bcl-2表达,下调Bax表达,同时下调Caspase-3蛋白表达而起到抑制心肌细胞凋亡作用。实验三:黄芪保心汤含药血清对AngⅡ诱导内质网应激心肌细胞凋亡的影响目的:验证黄芪保心汤含药血清抑制AngⅡ诱导内质网应激心肌细胞凋亡的作用。方法:1.原代培养乳鼠心肌细胞及鉴定。对新生乳鼠进行体外心肌细胞的原代培养,予台盼兰活力检测,并予形态学及α-actin染色鉴定。2.建立AngⅡ诱导凋亡心肌细胞模型。予不同浓度AngⅡ、不同时间培养,并对培养后的心肌细胞TUNEL染色,检测出TUNEL染色中阳性细胞比例最高的实验条件,并以该条件卜的AngⅡ浓度和培养时间作为本实验最适浓度和最佳时间,进行造模。3.黄芪保心汤含药血清的制备方法及体系中血清添加量的确定。正常SD大鼠黄芪保心汤浓缩液灌胃给药,每日2次,连续给药7天,于末次给药后采血。无菌条件下分离血清,滤过后冻存。通过MTT法细胞活性检测确定体系中最佳空白血清添加量。HPLC法确定给药后最佳采血时间。SD大鼠灌胃,据末次给药后间隔时间分组取血,检测不同采血时间点含药血清的HPLC色谱图,以"归一化法"记录各时间点色谱峰的总面积,通过对不同采血时间点色谱图总面积的计算比较,最后确定最佳采血时间。4.黄芪保心汤含药血清的制备及分组。32只雄性SD大鼠,随机分成4组,每组8只。分别为空白血清组、低剂量含药血清组(28.25 g/kg)、中剂量含药血清组(56.5 g/kg)及高剂量含药血清组(113 g/kg)。各给药组按照相应剂量分别灌胃给药,空白对照组给予相同体积的无菌水,连续7天,每天2次。在末次给药后60 min,对大鼠进行下腔静脉采血,无菌制备空白血清及黄芪保心汤低、中、高剂量组含药血清。5.体外原代培养并鉴定的心肌细胞,分7组分别为:正常对照组、空白血清组、AngⅡ组、低、中、高剂量含药血清组和卡托普利组,后5组予上条件下AngⅡ诱导的凋亡心肌细胞。上7组培养24 h后,采用Annexin V-FITC/PI凋亡流式检测各组细胞凋亡水平,并通过Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bc1-2、Bax及Caspase-3的表达水平,同时予Western blotting法检测ERS分子伴侣GRP78、相关凋亡通道蛋白Caspase-12和CHOP等的蛋白表达。结果:1.心肌细胞培养成功,台盼兰染色法检测细胞活力≥90%,α-actin染色鉴定显示心肌细胞阳性率≥95%。本实验AngⅡ造模最佳浓度为10-7 mol/L,最佳时间为24 h。TUNEL示凋亡比例最高。2.体系中加入血清的最佳比例为20%,该条件下血清对乳鼠心肌细胞正常活性基本无明显影响。HPLC法确定按人临床用药等效剂量的5倍,每日两次、连续7天灌胃给药,于末次给药60 min时采血所得的含药血清中成分的总峰面积最大。3.与正常对照组比较,空白血清组心肌细胞凋亡水平、Bcl-2、Bax、Caspase-3、GRP78、Caspase-12和CHOP变化均无统计学意义(P0.05)。与正常对照组比较,AngⅡ组心肌细胞凋亡水平明显增加(P0.01);促凋亡因子Bax和Caspase-3蛋白表达增加,抗凋亡因子Bcl-2降低(P0.05);ERS相关凋亡因子GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白表达增加(P0.05)。与AngⅡ组相比,低、中、高剂量组含药血清可不同程度降低细胞凋亡水平(P0.01);但低剂量组对 Bcl-2、Bax、Caspase-3、GRP78、Caspase-12 和 CHOP 的蛋白表达水平无明显改善(P0.05),而中、高剂量组可明显降低促凋亡因子Bax和Caspase-3的蛋白表达,上调抗凋亡因子Bcl-2的蛋白表达(P0.05);降低GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白表达水平(P0.05)。上述作用呈一定的剂量依赖性,高剂量组与阳性药物卡托普利组无统计学差异。(P0.05)结论:AngⅡ可诱导ERS介导细胞凋亡的发生,而黄芪保心汤可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡。其机制可能是通过抑制ERS,降低分子伴侣GRP78表达水平,抑制下游的Caspase-12和CHOP凋亡通路,进而上调Bcl-2表达水平,降低Bax、Caspase-3的蛋白表达而起到抑制心肌细胞凋亡作用。


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