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抗骨接生软膏药学研究及斑马鱼评价

陈颖  
【摘要】:本研究分为两个部分:一是抗骨接生软膏的药学研究;二是基于斑马鱼M-Act/Tox 一体化评价技术解析淫羊藿抗骨质疏松物质基础。第一部分内容:抗骨接生软膏的药学研究抗骨接生软膏系江苏省中医药研究院骨伤科用于治疗膝骨关节炎、腰椎骨关节炎、肩周炎,等证属阳虚寒凝,瘀血阻滞者的经验方。由花椒、艾叶、苍术、独活、桂枝、红花等10味组成,而现有处方为病人自己打粉搅拌后外敷,极其不方便。本课题在中医药理论指导下,将其制成软膏便于携带及贮存。按照国家药品监督管理局《药品注册管理办法》及《医疗机构制剂注册管理办法(试行)》的相关法律法规要求,对抗骨接生软膏进行了药学研究,内容包括文献研究、制备工艺研究、质量标准研究、稳定性的药学研究,进一步进行皮肤刺激性及斑马鱼初步评价研究。此外,淫羊藿为骨伤科常用中药,其潜在肝毒副作用引起重视,毒/效物质基础亟待明晰,本文用模式生物斑马鱼M-Act/Tox(Metabolism-Action/Toxicity)—体化评价技术解析淫羊藿抗骨质疏松物质基础。1.文献研究在绪论部分阐述了国内外治疗关节炎的研究进展,对抗骨接生方中主要药味的理化性质和药理作用进行归纳总结。2.抗骨接生软膏制备工艺研究对抗骨接生软膏进行了打粉和制剂成型研究,以出粉率及粉碎特点即粉碎难易程度和粘壁与否为考察指标,按照药材性质分为单独打粉、分类打粉和全方混合打粉,优选出打粉工艺为全方混合打粉。确定选用基质为甘油和凡士林后,以湿度、粘稠度和混合性能为考察指标,采用单因素及正交L9(34)考查基质用量及配比、搅拌温度、药粉与基质加入混合方式对抗骨接生软膏成型的影响。将山梨酸钾、苯甲酸钠和尼泊金乙酯等防腐剂进行对比,确定选用苯甲酸钠为防腐剂,3批小试及3批中试后最终确定成型工艺确定工艺为:以上十味,混匀,粉碎成细粉,加入甘油600g,凡士林200g以及苯甲酸钠3.3g(用少量水溶解),混匀,制成1100g,即得。3.抗骨接生软膏的质量标准研究为使抗骨接生软膏质量可控,对其性状、鉴别、检查、含量测定等方面进行了考察,建立了桂枝、红花、独活等的薄层鉴别方法。采用HPLC建立独活中蛇床子素含量测定方法,规定了含量限度,制定了质量标准(草案)。计算平均值为1.06mg/10g软膏,按含量下限取平均值的60%为0.636 mg/10g软膏,暂规定本品每10g含独活以蛇床子素(C15H1603)计,不得少于 0.60mg。4.抗骨接生软膏的稳定性研究根据《中药、天然药物稳定性研究技术指导原则》,考察药品的稳定性,确定有效期,进行影响因素试验;对三批中试样品进行了光照高温影响因素试验、6个月的加速稳定性试验和12个月的长期稳定性试验。对其性状、鉴别、含量测定等进行稳定性考察,考察结果显示本品质量稳定。5.皮肤刺激性及斑马鱼评价研究给家兔背部涂抹抗骨接生软膏Oh~72h未出现血管、肌肉、皮肤黏膜等部位接触受试药物后引起红肿、充血、渗出、变性或坏死等局部反应等不良反应。并用斑马鱼模型评价了抗骨接生方的安全性。第二部分内容:基于斑马鱼M-Act/Tox 一体化评价技术解析淫羊藿抗骨质疏松物质基础研究1.对不同品种淫羊藿提取物,淫羊藿中不同组分(淫羊藿总黄酮、生物碱、有机酸及多糖)及代表成分(8个黄酮、3个有机酸和1个生物碱)用斑马鱼进行抗骨质疏松活性与安全性评价,以黄酮成分为主要指标,考查其经斑马鱼的代谢特点,及其它组分(生物碱、有机酸和多糖)对黄酮成分M-Act/Tox特性影响。2.用斑马鱼评价抗骨质疏松活性发现:不同品种淫羊藿均有抗骨质疏松活性;淫羊藿黄酮成分是主要抗骨质疏松活性成分,淫羊藿提取物及黄酮组分/成分的作用机制主要为下调RANKL的表达,抑制骨吸收。有机酸类成分具有一定抗骨质疏松活性,而生物碱和多糖没有活性。3.用斑马鱼评价安全性发现:不同品种淫羊藿对斑马鱼的毒性具有差异,致斑马幼鱼不同程度卵黄囊肿大、变黑或变形,淫羊藿50%提取物对骨质疏松模型鱼的毒性较健康鱼大;不同组分安全性具差异:淫羊藿生物碱和黄酮对斑马鱼有一定毒性,其次是有机酸类,多糖成分安全性最好;淫羊藿黄酮单体的安全性不同:箭藿苷B,箭藿苷C朝藿定C,箭藿苷A淫羊藿苷,宝藿苷I,朝藿定A和朝藿定B,黄酮对斑马鱼的毒性包括代谢增毒和代谢减毒两方面;绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸及木兰花碱毒性较低。4.用斑马鱼对淫羊藿的黄酮组份/成分的代谢研究发现:淫羊藿黄酮具共同的脱糖基代谢规律,经斑马鱼代谢后,即7位葡萄糖基易脱去,3位葡萄糖基和3位木糖基易脱去,但鼠李糖基难于脱去,即多种淫羊藿黄酮在体内主要转化成共含鼠李糖基的双糖苷箭藿苷C或单糖苷宝藿苷I,朝藿定A、朝藿定B、淫羊藿苷和箭藿定B的主要代谢产物均为BI,朝藿定C的主要代谢产物箭藿苷C;PN模型鱼对淫羊藿黄酮成分的代谢速度一般较健康鱼略快。5.用斑马鱼模型评价不同组分对淫羊藿黄酮成分M-Act/Tox的影响:多糖类成分可明显加速淫羊藿黄酮成分代谢转化,增加黄酮毒性;有机酸类成分可减慢淫羊藿黄酮成分代谢转化,但不会明显影响黄酮毒性;生物碱类对淫羊藿黄酮成分代谢速度影响不大,但增加黄酮毒性。淫羊藿多糖类、有机酸类及生物碱类成分不会显著影响黄酮成分的抗骨质疏松活性。


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