荆三棱乙酸乙酯部位抗肿瘤转移作用研究

【摘要】：荆三棱(Scirpus yagara Ohwi)是莎草科藨草属植物,其干燥块茎具有破血行气和消积止痛的功效,常用于治疗瘀血、癥瘕痞块等。现代药理学研究表明,荆三棱具有抗病毒、抗肿瘤和抗炎作用。近年来大量研究证明,炎性微环境是癌症的第7个标志,慢性非可控性炎症与多种恶性肿瘤的发生、进展密切相关。肿瘤微环境中,TLRs诱导的炎症是持续低度恶性炎症反应的主导者,能够促进肿瘤发生和转移。本文通过激活TLRs信号诱导黑色素瘤转移为模型,研究荆三棱抗肿瘤转移作用。中药药效物质基础是中医药现代化研究的热点和难点,也是中医药现代化研究的关键。为了探寻中药药效物质,肖小河等首次提出“基于目标成分敲除/敲入的中药药效物质辨识”的研究设想,快速准确地锁定中药药效的关键组分。本研究基于“成分敲除”模式研究荆三棱乙醇提取物中抗肿瘤转移的主要成分。乙醇提取物中依次敲除石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位四个目标成分,以小鼠黑色素瘤B16细胞体外抗肿瘤转移为模型,采用MTT法确定目标成分和目标成分阴性样品对细胞活力无影响的浓度范围,以划痕法和Transwell侵袭法,研究目标成分和目标成分阴性样品对脂多糖(LPS,TLR4配体)诱导的B16细胞迁移和侵袭的影响。结果显示,1)与空白组相比,目标样品与其阴性样品(C≤100 μg/mL)和乙醇提取物(C≤25μg/mL)时,对B16细胞活力无显著影响;2)在乙醇提取物中,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位抑制LPS诱导的B16细胞迁移的贡献率分别是10.78%、42.87%、12.76%、4.6%;3)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位抑制LPS诱导的B16细胞侵袭的贡献率分别是-44.82%、45.38%、-60.11%、-55.61%;4)乙酸乙酯部位抑制LPS诱导的B16细胞迁移和侵袭的抑制率分别是55.07%和63.01%,均高于其他目标成分。在乙醇提取物对LPS诱导的B16细胞迁移和侵袭中,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位之间存在明显拮抗作用,而乙酸乙酯部位的抑制作用最明显,贡献率最高,乙酸乙酯部位可能是荆三棱乙醇提取物中抑制LPS诱导的B16细胞迁移和侵袭的主要活性部位。进一步,研究乙酸乙酯部位在LPS诱导B16细胞体内和体外抗肿瘤转移作用。采用MTT法确定乙酸乙酯部位对细胞活力无影响的浓度范围,然后以划痕法和Transwell侵袭法,研究乙酸乙酯部位对LPS诱导的B16细胞迁移和侵袭影响。通过尾静脉或脾脏,注射预处理的肿瘤细胞,建立小鼠肺转移模型和肝转移模型,研究乙酸乙酯部位体内抗肿瘤转移作用。结果显示,1)与空白组相比,乙酸乙酯部位浓度≤50 μg/mL时,对B16细胞活力无显著影响;2)10 μg/mL和50 μg/mL乙酸乙酯部位能剂量依赖性的降低LPS诱导的B16细胞迁移和侵袭;3)肺转移实验中,50μg/mL乙酸乙酯部位能明显减少LPS诱导B16细胞在肺表面形成的结节数,减轻小鼠肺重,降低血清和肺组织匀浆中炎性因子TNF-α和IL-6含量,HE实验也进一步揭示了50 μg/mL乙酸乙酯部位能降低LPS诱导的肺转移;4)肝转移实验中,50μg/mL乙酸乙酯部位能明显降低LPS诱导B16细胞在肝脏表面形成的结节数,减轻小鼠肝重,降低肝组织匀浆中炎性因子TNF-α和IL-6含量,与1 μMTAK242(TLR4拮抗剂,阳性药)抑制作用相当。为进一步探索荆三棱乙酸乙酯部位抗肿瘤转移作用的物质基础,采用高效液相色谱法分析测定乙酸乙酯部位主要成分,按结构类型选取其中代表性成分,采用划痕法和Transwell侵袭法研究它们对LPS和Pam3sck4(TLR2配体)诱导B16细胞的抗肿瘤转移作用及相互协同作用。结果表明,乙酸乙酯部位含有对羟基桂皮酸,阿魏酸等酚酸类以及2-羟基呫吨酮和三棱双苯内酯等多种成分,按结构类型选取其中8个代表性成分,分别是对羟基桂皮酸(p-coumaric acid,p-HA)、阿魏酸(ferulic acid,FA)、dehydrophyllodulcin(DPL)、2-羟基呫吨酮(2-hydroxy xanthone,2-HX)、双苯乙炔(methyl-3,6-dihydroxy-2-[2(2-hydrox yphenyl)-ethynyl]-benzoate,JCB8)、Sciryagarol Ⅰ(J1)、三棱双苯内酯 B(Sparstolonin B,SsnB)和三棱双苯内酯(SanLeng diphenyllactone,SA2),进一步研究它们的抗肿瘤转移作用及相互协同作用。发现异香豆素类化合物(DPL、SsnB和SA2)、呫吨酮类化合物(2-HX)和芪类化合物(J1)能显著抑制LPS诱导的B16细胞迁移和侵袭,异香豆素类化合物(DPL、SsnB和SA2)也能明显减少Pam3csk4诱导的B16细胞迁移和侵袭,并且不同类型化合物协同抑制作用比单独给药显著增加。而酚酸类化合物(p-HA和FA)对LPS诱导的B16细胞迁移和侵袭没有明显抑制作用。