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黄芪保心汤改善心梗后心衰大鼠心室重构及对PI3K/Akt/mTOR自噬转导通路调控机制研究

张庆  
【摘要】:背景心力衰竭(Heartfailure,HF)是临床上常见病多发病,是多种心血管疾病最终的转归,在心力衰竭发病的过程中,心室重构是一个重要的病理基础,如何控制甚至逆转心室重构并达到改善心功能的目的,一直是临床研究的热点和难点。自噬是细胞新陈代谢的一个重要过程,而通过对自噬通路的调控达到改善心室重构也是目前研究的热点,磷脂腺肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶点(P13K/Akt/mTOR)作为自噬经典通路,在心衰的发病过程中具有重要作用,但目前中医药对于其在心衰治疗中的研究和报道仍比较少。实验一:黄芪保心汤改善心梗后心衰大鼠心室重构研究目的:探讨黄芪保心汤通过对炎症因子白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和心肌基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的调控,达到抑制心室重构,改善心功能的作用。方法:将120只SD大鼠随机分为假手术组(20只)和模型组(100只),假手术组仅穿线,不结扎前降支(LAD),模型组结扎LAD,饲养4周后,假手术组剩余14只,模型组通过彩超验证造模成功65只,随机分组给药如下:模型组(等量蒸馏水)、卡托普利组(6.75mg/kg/d)、黄芪保心汤低、中、高剂量(5.67g、11.34g、22.68g生药/kg/d),各组13只。喂药4周后,观察大鼠一般情况;心脏超声测量大鼠心脏形态结构及心功能指数;颈动脉插管检测大鼠血流动力学指标;使用酶联免疫吸附实验(ELISA)法来检测各组大鼠血清N末端脑钠肽前体(NT-ProBNP)、基质裂解素2(ST2)、IL-6、TNF-α、MMP-2、MMP-9变化;通过HE染色观察心肌组织形态结构改变。结果:与假手术组相比,模型组大鼠一般情况积分下降明显(P0.05),LVEDD、LVESD增高,EF、FS、SV 及 CO 值降低(P0.01);MAP、LVDP、+dp/dmax、-dp/dtma 及 LVSP数值降低(P0.01),LVEDP 数值增高(P0.01);血清NT-proBNP、ST2、IL-6、TNF-α、MMP-2、MMP-9数值均升高(P0.01);心肌细胞排列紊乱,大量纤维组织增生。与模型组比较,黄芪保心汤各组均可以不同程度地提高大鼠一般情况积分(P0.01);降低 LVEDD、LVESD 数值(P0.05,P0.01),提高 EF、FS、SV 及 CO 数值(P0.05,P0.01);提高 MAP、LVDP、+dp/dmax、-dp/dtma、LVSP 数值(P0.05,P0.01),降低 LVEDP 值(P0.05,P0.01);降低血清 NT-proBNP、ST2、IL-6、TNF-α、MMP-2、MMP-9含量(P0.05,P0.01);心肌细胞排列整齐、纤维组织增生减轻(P0.05,P0.01)。黄芪保心汤低、中、高剂量组呈现量效正向关系。结论:黄芪保心汤对心梗后心衰大鼠炎症因子IL-6、TNF-α和心肌基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9具有调控作用,可改善心脏形态结构和心肌重构,提高心功能。实验二:黄芪保心汤对心梗后心衰大鼠自噬表达及PI3K/Akt/mTOR传导通路表达影响的研究目的:探讨黄芪保心汤对心梗后心衰大鼠自噬表达及PI3K/Akt/mTOR自噬传导通路相关蛋白表达的影响。方法:本实验沿用实验一标本,通过电镜观察心脏组织双层膜囊泡结构的自噬体表达情况;通过免疫荧光法检测LC3表达情况;通过Western Blot技术检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62、Akt、mTOR蛋白表达及其磷酸化水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠心脏组织细胞双层膜囊泡结构的自噬体显著增加(P0.01);LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值升高,p62 降低(P0.01);p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值均有显著降低(P0.01)。与模型组比较,卡托普利组与黄芪保心汤各剂量组自噬体均有减少(P0.05,P0.01);LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值均降低,p62 均升高(P0.05,P0.01);p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值升高(P0.05,P0.01)。黄芪保心汤低、中、高剂量组呈现量效正向关系。结论:黄芪保心汤能够减少心梗后心衰大鼠自噬表达水平,具有降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,提高p62蛋白水平作用,同时能够降低PI3K/Akt/mTOR自噬传导通路Akt、mTOR磷酸化水平。实验三:黄芪保心汤含药血清通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路下调自噬水平,减轻心肌细胞缺氧/复氧(A/R)损伤目的:探讨黄芪保心汤含药血清通过对PI3K/Akt/mTOR自噬通路的调控,下调自噬水平,减轻缺氧/复氧心肌细胞损伤。方法:1、原代乳鼠心肌细胞培养及鉴定。取新生1-2天乳鼠心肌细胞进行体外原代培养,常规消化、分离后以5×105细胞/60-mm培养皿的密度接种。细胞常规换液、4天培养后进行造模。2、建立缺氧/复氧模型。把原代心肌细胞培养完成后,置入缺氧盒,缺氧12小时,复氧4小时。3、黄芪保心汤含药血清制备及最佳药物浓度和作用时间确定。将60只SD大鼠随机分成中药组和对照组2组,每组30只,中药组给予黄芪保心汤汤剂灌胃,对照组给予等体积的生理盐水灌胃,前4天按照常规饲养,在第4天末次灌胃之后撤掉饲料开始禁食,不禁水,于第5天取血前再连续灌胃2次,两次灌胃时间间隔1小时,于末次灌胃1小时后取血。通过CCK-8法和LDH法确定含药血清对心肌细胞最佳浓度和最佳作用时间。4、实验分组及给药方法:①对照组(Con):心肌细胞贴壁48h后正常孵育17h;②缺氧复氧组(A/R):心肌细胞贴壁48h后正常孵育1h,缺氧12h复氧4h;③含药血清(DS)+A/R组:心肌细胞贴壁48h后正常孵育0.5h后加入最佳浓度含药血清进行预处理0.5h,再行缺氧12h复氧4h;④雷帕霉素(Ra)+A/R组:心肌细胞贴壁48h后正常孵育0.5h后加入Ra进行预处理0.5h,再行缺氧12h复氧4h;⑤雷帕霉素+DS+A/R组:心肌细胞贴壁48h后加入Ra进行预处理0.5h,加入DS处理0.5h,再行缺氧12h复氧4h。⑥Akt信号抑制剂(API-2)+A/R组:心肌细胞贴壁48h后正常孵育0.5h后加入API-2进行预处理0.5h,再行缺氧12h复氧4h;⑦Akt信号抑制剂+DS+A/R组:心肌细胞贴壁48h后加入API-2进行预处理0.5h,加入DS处理0.5h,再行缺氧12h复氧4h。5、检测指标台盼蓝染色检测原代细胞活性;CCK-8、LDH检测黄芪保心汤含药血清最佳作用时间和浓度;透射电镜观察自噬体数量及形态;免疫荧光检测LC3变化;Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p62蛋白表达情况及p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值变化情况。结果:1.台盼蓝染色:与Con组相比较,A/R组细胞活性下降明显(P0.01);与A/R组比较,含药血清预处理明显减少细胞活性损失,提示含药血清对A/R心肌起到保护作用。2.透射电镜:与Con组相比较,A/R组自噬体数量明显增加(P0.01);与A/R组相比较,含药血清组自噬体数量明显减少(P0.01)。3.免疫荧光:与Con组线比较,A/R组自噬体大量增加(P0.01);与A/R组相比较,含药血清组自噬体明显减少(P0.01)。4.Western blot 法:4.1Ra对A/R心肌细胞自噬表达PI3K/Akt/mTOR通路的影响①Con组比较,A/R组LC3Ⅱ/Ⅰ的比值明显升高,而p62蛋白表达水平减少(P0.01);与A/R组相比较,DS+A/R组LC3-Ⅰ增加明显,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降明显,P62蛋白表达水平增多(P0.01);与A/R组比较,Ra+A/R组自噬水平进一步增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加(P0.01),但p62蛋白表达水平下降不明显,无统计学意义(P0.05);与DS+A/R组比较,Ra+A/R组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加明显(P0.01),p62蛋白表达减少明显(P0.01),与RA+A/R组比较,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62变化无统计学意义(P0.05)。②与Con组相比较,A/R组p-mTOR/mTOR比值降低明显(P0.01),与A/R组相比较,DS+A/R组p-mTOR/mTOR比值显著升高(P0.01);与A/R组比较,Ra+A/R组p-mTOR/mTOR比值下降明显(P0.01);与DS+A/R组比较,Ra+DS+A/R组组p-mTOR/mTOR 比值下降明显(P0.01);与 Ra+A/R 组比较,Ra+DS+A/R 组 p-mTOR/mTOR比值差异无意义(P0.05)。③与Con组相比较,A/R组p-Akt/Akt比值显著降低(P0.01),与A/R组相比较,DS+A/R组p-Akt/Akt比值显著增高(P0.01);与A/R组比较,Ra+A/R组p-Akt/Akt比值无明显差异(P0.05);与Ra+A/R组比较,Ra+DS+A/R组p-Akt/Akt比值仍然升高明显(P0.01)。4.2API-2对A/R心肌细胞自噬表达PI3K/Akt/mTOR通路的影响①与Con组比较,A/R组LC3Ⅱ/Ⅰ的比值明显升高,而p62蛋白表达水平减少(P0.01);与A/R组相比较,DS+A/R组LC3-Ⅰ增加明显,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下降明显,P62蛋白表达水平增多(P0.01);与A/R组比较,API-2组自噬水平进一步增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加(P0.01),p62蛋白表达水平下降明显(P0.01);与DS组比较,API-2+DS+A/R组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加明显(P0.01),p62蛋白表达减少明显(P0.01);与API-2+A/R组相比较,两组差异无显著差异(P0.05)。②与Con组相比较,A/R组p-mTOR/mTOR比值下降明显(P0.01),与A/R组相比较,DS+A/R 组 p-mTOR/mTOR 比值提高(P0.01);与 A/R 组比较,API-2+A/R 组p-mTOR/mTOR比值下降明显(P0.01);与DS+A/R组组比较,API-2+DS+A/R组p-mTOR/mTOR比值仍然下降明显(P0.01),与API-2组相比较,API-2+DS+A/R组p-mTOR/mTOR差异无统计学意义(P0.05)。③与Con组相比较,A/R组p-Akt/Akt比值下降明显(P0.01),与A/R组相比较,DS+A/R 组 p-Akt/Akt 比值升高明显(P0.05);与 A/R 组比较,API-2+A/R 组 p-Akt/Akt比值进一步下降(P0.01);与DS+A/R组比较,API-2+DS+A/R组p-Akt/Akt比值仍然下降(P0.01);API-2+A/R 组与 API-2+DS+A/R 组 p-Akt/Akt 差异无统计学意义(P0.05)。结论:1、黄芪保心汤含药血清预处理可以通过抑制自噬体形成来减轻A/R心肌损伤;2、黄芪保心汤可能通过PI3K/Akt/mTOR自噬转导通路介导了心肌细胞A/R过程中的自噬抑制作用。


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