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壳寡糖修饰的盐酸川芎嗪PLGA微球的制备及体外评价研究

吴铄珺  
【摘要】:川芎嗪是中药川芎中的主要有效成分,是一种活性生物碱一四甲基吡嗪,具有改善微循环、抗血小板聚集以及活血化淤等作用,近年其抗肿瘤作用也备受到关注,具有抑制肿瘤生长、转移,诱导肿瘤细胞凋亡和自噬等作用。但盐酸川芎嗪在体内半衰期短,生物利用度低,普通制剂需频繁给药,血药浓度波动大,给患者带来了不便,将其制成缓释制剂以微颗粒的形式进入体内,减轻不良反应,降低毒副作用,提高疗效。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)是一种可降解的功能高分子有机化合物,最终可分解为二氧化碳和水,对人体不产生危害,具有良好的成膜性能,所以在微球制备中常作为首选载体。壳寡糖是自然界中唯一带正电荷阳离子碱性氨基低聚糖,具有水溶性好、吸收能力强、生物相容性好等优点,同时对人体免疫调节、抗肿瘤、降血脂、抗氧化等生理活性有着重要作用。用带有阳离子的基团修饰PLGA,能提高药物的细胞黏附性和吸收,解决药物突释性、半衰期短、在体内给药部位不稳定、需频繁给药的问题。本文主要研究内容及结果如下:1.盐酸川芎嗪微球制备及工艺研究采用复乳-溶剂挥发法制备壳寡糖修饰的盐酸川芎嗪缓释微球,形成w/o/w的复乳,磁力搅拌,挥发有机溶剂,高速离心收集,通过EDC和NHS活化的方法,将PLGA的端羧基与壳寡糖的游离氨基共价连接,最终制得壳寡糖修饰的盐酸川芎嗪PLGA微球。通过单因素试验,以包封率为评价指标,考察影响微球质量的因素,采用正交试验进行优化,筛选出最佳的处方为PLGA浓度为50g/L,药物浓度为30g/L,内水相/油相比为1:10,外水相油相比为4:1,最佳处方制备的盐酸川芎嗪微球表面光滑圆整,包封率在60%以上。同时建立了制剂中盐酸川芎嗪含量测定方法,该方法准确度高,稳定性好,仪器精密度良好,可用于盐酸川芎嗪的含量测定。2.壳寡糖修饰的盐酸川芎嗪微球的表征通过扫描电镜观测盐酸川芎嗪微球的粒径大小和形态。固化的微球通过高速离心收集,用去离子水洗涤3遍,冷冻干燥,置于硅片上,真空下喷金,使用TM3000台式扫描电镜观测微球形态及大小。盐酸川芎嗪微球整体分散均匀,大小均一,个体之间无明显黏连,表面光滑,呈完整圆球形态,包封率和载药量较高。3.盐酸川芎嗪微球体外释放规律分别精密量取未经修饰盐酸川芎嗪微球混悬液、经壳寡糖修饰后微球混悬液及等质量的盐酸川芎嗪注射剂各lOml,置于预先处理好的透析袋中,密封后置于磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)中,于恒温水浴搅拌,随着药物逐渐被释放出来,每隔一段时间取缓释液,补液。盐酸川芎嗪注射剂在释放介质中释放较快,而未经修饰的盐酸川芎嗪微球在释放前期存在一定的突释现象,经修饰后的微球突释效应减小,24h达到平稳状态,累积释放量78.23%,显示出一定的缓释特性。4.体外细胞实验选用人乳腺癌MCF-7细胞、人肺腺癌A549细胞,用CCK-8法考察盐酸川芎嗪微球的细胞毒性。通过前期实验,初步筛选出最佳盐酸川芎嗪浓度为0.054mg/ml,作用时间为24h。HPLC检测两种细胞内盐酸川芎嗪浓度,由高到低依次为MCF-7A549细胞,具体分别为46.77μg/ml、30.38μg/ml。激光共聚焦观测经壳寡糖修饰的微球处理的细胞较未经壳寡糖修饰的微球组、川芎嗪对照组有明显荧光,MCF-7细胞较A549细胞荧光强度更大。结论:1.采用复乳-溶剂挥发法制备壳寡糖修饰的盐酸川芎嗪微球,工艺简单易行,条件温和,包封率、载药量均较高、结构稳定,可在室温下能够长期保存;2.通过扫描电镜观察微球表面形态,光滑圆整、尺寸可控;平均粒径为180.5μm,载药量达19.05%,包封率为68.16%。3.通过对微球修饰前后的体外药物释放行为进行考察,修饰后的微球由于外层包裹壳寡糖,药物须经壳寡糖缓慢降解后释放,故突释效应有所减小;4.由于壳寡糖分子量小,更容易进入细胞,在体外细胞实验中发现经壳寡糖修饰后的微球对肿瘤细胞有更强的靶向性,为川芎嗪靶向制剂的开发及应用提供参考。


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