收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

基于雌激素受体探讨藁本内酯对骨形成的影响及其相关机制

杨菲  
【摘要】:骨质疏松症(Osteoporosis,OP)的特征是骨量减少、骨的微观结构退化,最终导致骨脆性增加,容易发生骨折。当归芍药散(Danggui Shaoyao San,DSS)在临床上具有显著的抗OP作用,方中当归(Angelica sinensis(Oliv.)Diels;A.sinensis)是一种广泛用于治疗OP的中药,而藁本内酯(Ligustilide;LIG)是其主要活性成分之一。已经发现LIG具有广泛的药理活性,例如抗动脉粥样硬化、神经保护、抗癌、抗炎和镇痛等作用。然而,关于其抗OP的作用知之甚少。前期实验我们发现,DSS可以有效治疗双侧卵巢切除大鼠的OP,显著促进骨形成,本研究旨在前期基础上探讨方中具有突出活性的成分LIG对骨形成的保护作用并试图探究其发挥作用的相关机制。在前期文献研究和实验基础上,本课题主要围绕以下几点开展研究:1.LIG对斑马鱼OP的干预效应建立斑马鱼幼鱼骨形成抑制模型,分组如下:空白对照组(Control组),25 μM泼尼松龙(Prednisolone;Pred)模型组;10-8 M 17β-雌二醇(17β-estradiol;E2)组、10μM LIG组。斑马鱼受精3天(days post fertilization;dpf)后用泼尼松龙造模2天,后各组在造模的同时给药,4天后钙黄绿素染色显示,斑马鱼幼鱼用Pred造模后椎骨数目显著降低,LIG明显提高造模后斑马鱼骨量,增加成骨相关标志基因的mRNA水平。建立斑马鱼成鱼尾鳍再生抑制模型,分组如下:Control组,10 μM LIG加药组,25 μM Pred模型组,50 μM Pred模型组,25 μM Pred+10 μM LIG给药组,50 μM Pred+10μM LIG给药组。斑马鱼成鱼剪尾后,在14天内,单独进行LIG给药,未观察到对斑马鱼尾鳍再生有显著促进作用;剪尾后,25 μM和50μM Pred均能显著抑制斑马鱼尾鳍再生;在Pred造模同时,给予LIG,在第7天和第10天,LIG组斑马鱼尾鳍与25 μM Pred组相比,增长率为79%和45%,LIG组斑马鱼尾鳍与50 μM Pred组相比,增长率为65%和46%。建立斑马鱼细胞凋亡模型,分组如下:Control组,邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate;DBP)模型组,N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine;NAC)阳性药组,人参皂苷Rgl(ginsenoside Rgl;gRgl)阳性药组,LIG给药组和DSS给药组。30 hpf的斑马鱼给予低于10μ 浓度的DBP,在42 h内不影响幼鱼存活率,50和100μM DBP以时间-剂量依赖的方式降低存活率;在30 hpf的斑马鱼培养基中加入0.1、1、5、10和50 μM DBP造模18 h,即斑马鱼48 hpf后,吖啶橙染色发现10 μM和50 μM DBP显著诱导斑马鱼细胞凋亡。斑马鱼眼部细胞在72 hpf产生自发凋亡,并且与光照条件无关。模型基础上,LIG及DSS均能显著抑制斑马鱼细胞凋亡。2.LIG对成骨细胞分化及氧化应激损伤的影响成骨细胞(osteoblast;OB)分化实验采用MC3T3-E1细胞及骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells;BMSCs),用成骨分化液刺激成骨分化。茜素红s染色显示,在分化第14天,LIG显著促进MC3T3-E1细胞的钙化结节形成,并且在BMSCs中,分化第14天观察到更多的钙化结节产生。用H2O2诱导MC3T3-E1细胞建立OBs过氧化损伤模型,MTT实验及Western Blot实验发现H202显著降低MC3T3-E1细胞存活率和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。采用上述OBs过氧化损伤模型,MTT实验、Western Blot实验和PI/Annexin V-FITC流式细胞技术检测结果显示,LIG和DSS显著提高细胞存活率,抑制细胞凋亡。活性氧(reactive oxygen species;ROS)流式细胞技术检测发现,LIG和DSS还能有效的降低细胞中的ROS水平。3.LIG促OBs分化、抗OBs凋亡相关机制上述实验结果表明,LIG在体内和体外均能促进骨形成,为了进一步探究LIG促进骨形成的相关机制,我们进行了以下实验:(1)茜素红s染色及PCR实验检测结果显示,LIG在BMSCs分化第14天显著促进钙化结节的产生,提高成骨相关基因的mRNA水平,在OBs分化过程中加入雌激素受体(estrogen receptor;ER)抑制剂,结果发现GPR30的特异性拮抗剂G15可显著抑制LIG的上述作用,而ERα-36的特异性拮抗剂SNG1153和核ERs拮抗剂ICI182780对其没有显著影响。(2)用H202诱导MC3T3-E1细胞过氧化损伤后,PCR实验检测发现,LIG显著提高G蛋白偶联受体30(G protein-coupled estrogen receptor 30;GPR30)的mRNA水平;MTT实验观察加入ERs抑制剂后LIG的抗OBs过氧化损伤作用,发现当用LIG与G15共培养细胞时,LIG的促细胞存活作用明显受到抑制,加入ICI182780未观察到这种阻断作用。Western Blot实验结果显示LIG显著增加过氧化损伤后MC3T3-E1细胞中Bcl-2的表达,而G15逆转了LIG上述作用。(3)MC3T3-E1细胞过氧化损伤后,Western Blot实验结果显示LIG显著促进了氧化应激下MC3T3-E1细胞中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor;EGFR)及下游信号通路的磷酸化,并且G15可显著抑制EGFR和ERK1/2通路的激活。为了探究LIG抗OBs过氧化损伤过程中GPR30/EGFR通路的影响,我们在实验过程中加入G15和EGFR的特异性拮抗剂AG1478。Western Blot实验结果显示LIG可显著促进过氧化损伤MC3T3-E1细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的产生。免疫荧光实验结果表明,LIG能抑制细胞内Cleaved caspase 3蛋白表达。线粒体膜电位染色和ROS原位荧光染色实验结果显示,LIG能恢复线粒体膜电位并有效的清除细胞内ROS。G15和AG1478可显著抑制LIG的上述细胞保护作用。(4)同源建模法构建GPR30的3D模型,用LIG或GPR30配体与其进行分子对接,结果发现LIG与GPR30的结合能为-39.3723 kcal/mol,G15与GPR30的结合能为-37.3384 kcal/mol,G1与GPR30的结合能为-47.1075 kcal/mol,三个化合物与GPR30的3D结构模型的结合位点相似。研究结论:(1)LIG可以显著提高斑马鱼骨形成抑制模型的骨量,促进Pred造模的斑马鱼剪尾模型的尾鳍再生,抑制DBP造成的斑马鱼细胞凋亡,提示LIG可能在体内通过抗细胞凋亡作用促进骨形成。(2)LIG可以显著促进MC3T3-E1细胞和BMSCs的成骨分化,且DSS和LIG均能对过氧化损伤的OBs产生细胞保护作用,提示LIG和DSS在体外也能促进骨形成过程。(3)LIG显著提高MC3T3-E1细胞过氧化损伤后的GPR30 mRNA水平,提示LIG可能通过提高GPR30水平产生骨保护作用。(4)拮抗GPR30可以抑制LIG对OBs的促分化作用,并且减弱LIG对过氧化损伤的OBs的细胞保护作用,这提示LIG可能是通过作用于GPR30产生促成骨分化和细胞保护作用。(5)LIG可以促进EGFR及其下游信号通路的激活,拮抗GPR30可以抑制LIG对EGFR通路的激活作用,GPR30拮抗剂和EGFR抑制剂均能抑制LIG对过氧化损伤的OBs的保护作用,这提示,LIG发挥OBs保护作用可能与GPR30/EGFR通路相关。(6)LIG、G1、G15与GPR30的3D结构模型有相似的结合位点和较强的结合能,提示LIG可能是通过与GPR30结合的方式激活其下游信号转导,发挥骨保护作用。综上所述,LIG可能通过提高GPR30水平或直接激活GPR30及其下游信号通路,从而抗OBs过氧化损伤,增强OBs分化能力,促进骨形成,最终发挥骨保护作用。此外,LIG可能是DSS在治疗OP中发挥作用的有效活性成分之一,为DSS在OP的临床应用提供了更多的证据。上述发现也可能为OP的治疗提供更多的策略和靶点。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前16条
1 臧晓霞;纪明山;左平春;陈仕红;孙中华;杜芳;;啶酰菌胺对斑马鱼胚胎及成鱼的毒性[J];农药;2016年12期
2 沈自慧;杨淋清;吴德生;郭昱嵩;袁建辉;周丽;刘建军;庄志雄;;基于斑马鱼胚胎进行化学品毒性评价的方法[J];中国热带医学;2016年12期
3 王鸿奎;巩杰;王新;刘东;;非肌性肌球蛋白Ⅱ-C在斑马鱼胚胎发育过程中的表达[J];交通医学;2016年01期
4 郭樱子;栾亚楠;周玉玲;白承连;任湘鹏;;低剂量氯氟氰菊酯对斑马鱼胚胎运动行为的影响[J];温州医科大学学报;2016年07期
5 赵崇军;田敬欢;倪媛媛;冯娅茹;代一航;王金凤;樊娇娇;杨冉;马志强;林瑞超;;马钱子对斑马鱼胚胎发育的影响[J];中华中医药学刊;2016年11期
6 刘迎;胡燕;姜蕾;潘波;秦涵淳;林勇;;6种表面活性剂对斑马鱼胚胎发育的毒性效应[J];生态毒理学报;2014年06期
7 何秋霞;董贞兰;楚杰;孙桂金;韩利文;韩健;刘可春;;芦荟大黄素对斑马鱼胚胎发育及运动行为学的毒性研究[J];山东科学;2015年03期
8 陈怡君;蒲韵竹;颜慧;钟玉绪;王卓;李春杰;查晓丹;赵宝全;刘萍;;冰片对斑马鱼胚胎发育的安全性评价[J];中国药房;2014年19期
9 刘迎;胡燕;姜蕾;潘波;秦涵淳;林勇;;5种酰胺类除草剂对斑马鱼胚胎发育的毒性效应[J];农药;2014年11期
10 王雪;彭维兵;王希敏;刘可春;陈锡强;张云;;富马酸二甲酯对斑马鱼胚胎早期发育的影响[J];动物学杂志;2013年04期
11 张红翠;王晓伟;徐晓敏;鲁疆;安晓晶;许波;马成俊;张红;王振华;;斑马鱼胚胎和肿瘤细胞评价细胞毒药物活性比较研究[J];现代生物医学进展;2012年27期
12 王亮;杨景峰;王亚臣;乔新国;包桂英;;甲拌磷对斑马鱼胚胎的毒性研究[J];内蒙古民族大学学报(自然科学版);2011年03期
13 刘在平;张松林;李运彩;王红;卢强;;斑马鱼胚胎在生态毒理学研究中的应用[J];科学技术与工程;2010年14期
14 王艳萍;洪琴;郭凯;池霞;郭锡熔;童梅玲;;多氯联苯暴露对斑马鱼胚胎发育的毒性效应[J];南京医科大学学报(自然科学版);2010年11期
15 周炳;赵美蓉;黄海凤;;4种农药对斑马鱼胚胎的毒理研究[J];浙江工业大学学报;2008年02期
16 王蕊,殷浩文;斑马鱼胚胎发育中适宜的毒理学指标分析[J];环境与职业医学;2004年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 沈自慧;吴德生;郭昱嵩;;基于斑马鱼胚胎进行化学品毒性评价的方法[A];2016年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2016年
2 陈锡强;韩利文;王希敏;王思锋;侯海荣;刘可春;;促渗剂氮酮对斑马鱼胚胎的透皮作用及其毒性影响(英文)[A];2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集[C];2012年
3 张利军;郭家彬;苑晓燕;史慧勤;赵君;束玉磊;彭双清;;应用斑马鱼胚胎和幼鱼评价布洛芬的心脏毒性[A];2013年(第三届)中国药物毒理学年会暨药物非临床安全性评价研究论坛论文摘要[C];2013年
4 侯佳;桂永浩;张立凤;王跃祥;宋后燕;钟涛;;视黄酸缺乏对斑马鱼胚胎心脏发育的影响[A];中华医学会第五次全国儿科中青年学术交流大会论文汇编(上册)[C];2008年
5 常成;朱加进;孙启;;瓶装水对斑马鱼胚胎生长发育的影响[A];2017浙江省营养学会年会暨西湖营养学术论坛资料汇编[C];2017年
6 于永利;杨景峰;王思珍;董武;;高残留农药福美双对斑马鱼胚胎体节以及脊索的影响[A];持久性有机污染物论坛2010暨第五届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集[C];2010年
7 巴雅斯胡;杨景峰;于永利;王思珍;董武;;高残留农药代森锌诱导斑马鱼胚胎脊索变形[A];持久性有机污染物论坛2011暨第六届持久性有机污染物全国学术研讨会论文集[C];2011年
8 杨维超;苑晓燕;张利军;吴卫东;彭双清;;纳米二氧化硅致斑马鱼胚胎发育毒性的初步研究[A];2014线粒体毒性与基于毒性通路的安全性评价新策略学术研讨会暨中国毒理学会毒理学替代法与转化毒理学专业委员会成立大会论文集[C];2014年
9 涂文清;徐超;刘维屏;;乙草胺对于斑马鱼胚胎在发育和免疫毒性方面的对映体选择性[A];第四届全国分子手性学术研讨会暨2011绿色手性论坛论文摘要集[C];2011年
10 朱小山;朱琳;李燕;端正花;;富勒烯(C_(60))对斑马鱼胚胎发育毒性的初步研究[A];第三届全国环境化学学术大会论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 谢华平;利用斑马鱼模型研究Pygo1与fhlA基因的发育生物学功能[D];湖南师范大学;2012年
2 倪睿;Hars非经典功能调控斑马鱼血管发育机制研究[D];西南大学;2018年
3 熊舒婷;miR-200家族在斑马鱼生殖发育中的功能研究[D];华中农业大学;2018年
4 路畅;Dmrt2a和igf2bp1在斑马鱼胚胎发育中的功能研究[D];华中农业大学;2017年
5 邢延奕;斑马鱼dishevelled家族基因调节胚胎图式形成和原肠运动的突变分析[D];山东大学;2018年
6 肖超强;利用斑马鱼探讨氟喹诺酮结构与毒性的关系研究[D];北京协和医学院;2018年
7 施旭来;miR-129-3p在斑马鱼胚胎中的神经保护作用及其机制研究[D];山东大学;2018年
8 黄志斌;c-Myb和C/ebpl在斑马鱼粒细胞发育及疾病形成中的机制研究[D];南方医科大学;2015年
9 康桂英;对乙酰氨基酚在斑马鱼体内的毒性研究[D];内蒙古农业大学;2017年
10 张维红;两种多发性骨髓瘤斑马鱼模型的建立及初步应用[D];天津医科大学;2016年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 高彦杰;两种Bt蛋白及转cry1C基因水稻对斑马鱼的安全评价[D];中国农业科学院;2019年
2 杨菲;基于雌激素受体探讨藁本内酯对骨形成的影响及其相关机制[D];南京中医药大学;2019年
3 胡玉环;CYP3A65代谢活化BDE47影响斑马鱼甲状腺激素稳态的机制研究[D];南京医科大学;2019年
4 肖伟洋;三丁基锡(TBT)对斑马鱼成鱼配子发生和繁殖行为的影响研究[D];重庆师范大学;2019年
5 吕亚旗;UNC5C在淋巴管系统发育中的作用研究[D];厦门大学;2017年
6 于翠霞;斑马鱼病原菌的鉴定和药物敏感性分析[D];华中师范大学;2017年
7 张意;富硒螺旋藻对高效氯氰菊酯染毒斑马鱼生殖和发育保护作用的研究[D];安徽大学;2019年
8 刘广夫;铜绿微囊藻对斑马鱼的毒性作用机制研究[D];浙江工业大学;2018年
9 黄伟康;两种双酰胺类杀虫剂对斑马鱼胚胎毒性机理初步研究[D];海南大学;2017年
10 陈永军;Rab34对斑马鱼发育及乳腺癌细胞迁移、侵袭影响的研究[D];厦门大学;2017年
中国重要报纸全文数据库 前6条
1 实习生 杨阳;斑马鱼可为癌症病人试药[N];科技日报;2017年
2 记者 张梦然;燃煤中发现未知潜在毒副产品[N];科技日报;2017年
3 记者 刘霞;科学家绘出首个脊椎动物发育蓝图[N];科技日报;2008年
4 记者 陈丹;研究发现一些3D打印物品有毒[N];科技日报;2015年
5 记者 毛黎;2008年10大科学突破[N];科技日报;2008年
6 本报驻日内瓦记者 陈建;“中国创新”领跑日内瓦发明展[N];经济日报;2015年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978