荆三棱化学成分对脑出血和肿瘤转移的影响研究

【摘要】：荆三棱(Scirpus yagara)作为常用中药,具有破血行气和消积止痛的功效。药理学研究发现,荆三棱提取液具有抗炎、抗肿瘤转移、保护心脑血管等作用。近年来,国内外学者从荆三棱块茎中分离得到了大量化学成分,包括异香豆素类、蒽醌类、茋类以及黄酮类等。本论文以荆三棱块茎中的抗炎活性成分sparstolonin B(SsnB)、dehydrophyllodulcin(DPL)和sciryagarol Ⅰ(J1)为研究对象。借助胶原酶注射大鼠脑出血模型,探究SsnB对大鼠脑出血后继发性脑损伤的保护作用,并初步探究其可能的作用机制;通过激活TLRs,诱导肿瘤细胞体外转移模型,探究DPL和J1对炎症诱导的肿瘤转移作用。论文研究内容主要包括以下几个部分:一、Sparstolonin B(SsnB)的全合成制备、纯度测定及溶解度研究SsnB最初从荆三棱块茎中分离得到,但由于其在植物中的含量低,提取分离难度大,成本高,且溶解性差,很难满足药物研究和药用的需求。因此,本实验根据文献报道的全合成方法对其进行了全合成制备,并通过标准品(植物来源)的薄层色谱比对法和LC-MS确定其结构;再通过高效液相色谱法,按峰面积归一化法计算其纯度;进一步考察了其溶解度,以便更好的进行动物给药。结果显示:1)以10 g2-糠酸甲酯为原料,经过十三步反应(包括傅克反应、Diels-Alder反应、还原反应等),最终合成SsnB约1.1 g;2)在365 nm检视下,合成的SsnB供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的淡黄色荧光斑点;3)LC-MS中,合成的化合物液相色谱在保留时间t=3.986 min时出峰,对其进行质谱分析,在负离子模式下,测得[M-H]-峰为267.0,相对分子质量为268,与薄层鉴别法共同确定该化合物为SsnB;4)由高效液相色谱法测得SsnB的纯度为98.49%,可进行动物给药;5)溶解度结果表明,SsnB易溶于1 mol/L的氢氧化钠,溶解于二甲基亚砜,略溶于四氢呋喃,溶解性较差,溶解给药时可以辅以二甲基亚砜助溶。二、SsnB对大鼠脑出血后继发性脑损伤的保护作用研究前期研究发现,在脑出血的自体血模型中,SsnB对脑出血后大鼠的脑损伤有很好的抑制作用。与自体血模型相比,胶原酶注射大鼠脑出血模型与人类脑出血的病理生理变化相似性较大,更适合于研究药物对脑出血后神经功能缺损的保护作用及治疗效果。于是进一步用脑出血大鼠胶原酶模型进行验证。实验观察出血后的第1、3、5、7天SsnB对脑出血大鼠神经功能缺损评分(modified neurological severity score,mNSS),脑组织含水量的影响。通过ELISA法检测脑出血大鼠脑组织匀浆中炎性细胞因子IL-6和TNF-α的含量变化。结果显示:1)SsnB 25 mg/kg组在造模后的第1、3、5天均能明显改善大鼠的神经功能缺损,而10 mg/kg组则在第3天和第5天能显著降低脑出血大鼠的神经功能缺损;2)10和25mg/kg剂量的SsnB均能显著降低脑出血大鼠同侧脑组织中的含水量;3)25 mg/kg组在造模后的第1、3、5天均显著抑制TNF-α和IL-6的表达水平;10 mg/kg组在造模后的第1、3、5天能显著抑制TNF-α的表达水平,而在IL-6的表达水平上无显著差异。结论:10和25 mg/kg剂量的SsnB在大鼠脑出血后的第1、3、5天均能起到重要的保护作用,对早期的炎症起到了显著的抑制作用,其作用机制可能是保护了大脑中的小胶质细胞,减少了神经元损伤,同时降低了脑组织的含水量和炎性因子的表达。三、Dehydrophyllodulcin、Sciryagarol I对炎症诱导的肿瘤转移作用研究首先,采用MTT法检测了DPL和J1对四种肿瘤细胞小鼠黑色素瘤细胞B16、人肝癌细胞HepG2、人乳腺癌细胞MCF-7以及人肺癌细胞A549变异率的影响,以获得化合物对肿瘤细胞无毒性的最大试药浓度。然后分别以LPS(TLR4配体)和Pam3csk4(TLR2配体)为诱导剂,研究DPL和J1对四种肿瘤细胞的迁移、侵袭和粘附能力的影响。结果显示,1)DPL对四种细胞的最大试药浓度均为5 μM,J1对四种细胞的最大试药浓度均为20μM;2)DPL和J1均能剂量依赖的抑制LPS诱导的四种肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,也能够抑制Pam3csk4诱导的B16、HepG2和A549细胞的迁移和侵袭能力;3)5μM的DPL能明显降低LPS和Pam3csk4诱导的HepG2细胞对纤连蛋白的粘附能力,2 μM的DPL和不同剂量的J1均能够明显降低LPS诱导的HepG2细胞对纤连蛋白的粘附能力,但对Ⅰ型胶原均无效。