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利用中药废弃物发酵生产灵菌红素的研究

倪亮  
【摘要】:本论文共分为三章内容。一、文献研究本章对灵菌红素相关文献进行了分析研究,对灵菌红素化学结构、发酵工艺、生物活性以及合成途径进行了系统归纳和总结,以期为本研究发酵生产灵菌红素研究提供思路与参考。在此基础上,对利用废弃物发酵生产灵菌红素应用研究进行了归纳整理,以期为精细化利用中药废弃物发酵生产灵菌红素提供更多的手段与技术,为中药废弃物微生物转化利用途径提供了可靠的支撑。二、利用中药深加工过程油脂类副产物发酵产灵菌红素的菌株筛选及工艺优化研究实验采用选择性培养基筛选出可以利用苦参种子油为唯一碳源的产灵菌红素菌株,经形态学观察及16S rDNA鉴定显示其为粘质沙雷氏菌,命名为粘质沙雷氏菌L9。通过单因素考察和响应面优化方法获得粘质沙雷氏菌L9菌株利用苦参种子油发酵产灵菌红素的最佳工艺参数为:苦参种子油12.93 g/L、牛肉膏9.47g/L和氯化钙0.3 g/L。经优化后的培养基称为苦参种子油培养基,在30℃,180 r/min摇瓶发酵条件下,灵菌红素产量最高,预测产量为 332.37 mg/L。在此基础上,对L9菌株利用不同中药药渣中油脂类成分发酵生产灵菌红素的普适性和差异性进行研究,结果显示:苦参种子油与其它四种药渣油脂灵菌红素产量在200-350mg/L之间,决明子药渣油脂产量低至5.72mg/L,菌体生长基本停滞,说明了L9菌株利用不同种类中药药渣油脂有着一定的普适性和差异性。通过气质联用测定六种中药废弃物油脂中脂肪酸类型和比例。发现苦参种子油、酸枣仁药渣油、瓜萎子药渣油、桃仁药渣油、杏仁药渣油中不饱和脂肪酸比列都比较高,而决明子中不饱和脂肪酸含量仅为58.29%,相对其他药渣油决明子药渣油饱和脂肪酸比例相对较高不饱和脂肪酸含量较低。实验进一步对不同种子类药渣油脂中脂肪酸组成进行了分析,通过R语言对两组数据进行相关性研究,实验发现油脂中不饱和脂肪酸比例和灵菌红素产量成明显的正相关,饱和脂肪酸比例和灵菌红素产量成负相关,其中棕榈酸和硬脂酸也和灵菌红素的产量成负相关。结果提示粘质沙雷氏菌L9利用油脂可能有一定的偏好性,不饱和脂肪酸会促进菌体产生灵菌红素,饱和脂肪酸会抑制菌体灵菌红素的合成,废弃物油脂中不饱和脂肪酸比例越高,粘质沙雷氏菌L9对于此类油脂的利用率越高。本实验基于之前的研究调查发现,产地中药僵蚕药材中有部分红色僵蚕,经前期研究发现僵蚕表面红色物质为灵菌红素,说明僵蚕可能是粘质沙雷氏菌L9潜在的优质氮源。通过单因素和响应面优化,得到培养基的最佳浓度:僵蚕药渣22.00 g/L、杏仁药渣油14.13 g/和硫酸镁0.35 g/L。经优化后的培养基称为全中药废弃物培养基,在30℃条件下,180 r/min摇瓶发酵,灵菌红素产量最高,结果显示在最初优化发酵条件下,以苦参种子油牛肉膏发酵生产灵菌红素的产率317.23 mg/L。全中药废弃物培养基发酵培养条件进行发酵灵菌红素实际产量平均值为2.758 g/L,比优化前初始产率提高近8.7倍。在有效处置中药固废物的同时产生灵菌红素高附加值产品,为中药废弃物资源的提质增效提供了科学依据,也为种子类药材深加工过程固废物、动物类药渣的资源化利用提供了借鉴。三、基于中药废弃物发酵生产灵菌红素的应用研究本章考察了灵菌红素的提取、分离、纯化以及鉴定技术,对不同溶剂和萃取方式进行了比较,发现乙醇灵菌红素的萃取效率较高,适合作为灵菌红素工业生产的萃取原料。超声破壁处理方法简洁方便且耗时较少,适合作为灵菌红素工业化生产过程中的破壁方法。运用灵菌红素的薄层层析考察硅胶柱色谱的洗脱系统,使用硅胶柱色谱对灵菌红素初步分离,再通过高压制备、Sephadex LH-20凝胶纯化得到纯度较高的灵菌红素标品。对灵菌红素标品与三种中药废弃物种子油发酵液的色谱图做比较,出峰时间一致。对灵菌红素纯化品进行UPLC-Q-TOF-MS/MS图谱分析,对比碎片信息与文献报道预测值(324.2070),确定灵菌红素的结构信息。基于肉汤微量稀释法确定灵菌红素纯化标品的最小抑菌浓度(MICs),研究了灵菌红素纯化标品对常见的革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的抑菌活性。灵菌红素对痢疾志贺氏菌具有显著的抗菌活性,灵菌红素对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性。研究表明灵菌红素对于常见的细菌具有一定的抑菌活性,但并不是广谱的抑菌物质。工业生产需要一种染色度好且抗菌的天然染料,可以考虑在灵菌红素中加入其它天然的抗菌物质起到协同增效的目的,发现适用于工业化生产的灵菌红素类抗菌染料。


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