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“崩漏停”物质基础初步研究及红眼树蛙中多肽的克隆和效应评价

张焱  
【摘要】:崩漏,又被称为功能性子宫出血,在女性中的总发病率约为20%~22%,临床表现为月经周期失去正常规律,经量过多,经期延长,阴道不规则流血等,对患者的日常生活造成严重的影响。崩漏停为临床经验方,在多年的使用中表现出良好的疗效,且用药量少,患者依从性较好。但是其起效成分尚不明确,阻碍其进一步的发展与应用。因此,本论文旨在研究其治疗功能性子宫出血的物质基础。论文共分为五章,第一章系统地介绍了崩漏、崩漏停中各组成药味(蒲黄、五灵脂、三七、当归、醋香附)化学成分及中药复方物质基础的研究进展。第二章至第五章为实验部分,其具体的研究内容和相应结论如下:崩漏停中间体制备工艺研究:崩漏停组方为蒲黄、五灵脂、三七、当归、醋香附,需对其进行中间体的制备,为后续的实验提供质量稳定的供试品,因此本节首先对中间体制备的工艺路线进行考察。首先,以各药材中指标成分的相对提取率及小鼠凝血和出血实验结果为指标,对三条工艺路线(路线一:全方水提醇沉;路线二:当归、醋香附、三七三味饮片醇提,药渣与蒲黄、五灵脂合并水提醇沉;路线三:蒲黄、当归、醋香附、三七四味饮片醇提,药渣与五灵脂合并水提醇沉)进行考察,考察结果显示其中工艺三最优。确定大体工艺路线后,对醇回流提取及水提次数进行优选。结果显示蒲黄、三七、当归、醋香附醇提1次,药渣与五灵脂合并,加水煎煮2次较为合理。筛选得到较优的工艺路线后,对其中的工艺条件进行优选,包括不同水平的醇浓度、加醇量、醇提时间、水提时间、加水量、用于醇沉的药液浓度、醇沉浓度及醇沉时间进行考察。最终确定的崩漏停中间体制备工艺为取蒲黄、三七、当归、醋香附,加60%乙醇9倍量,加热回流提取1.5小时,滤过得醇提液,备用。经醇提后的药渣与五灵脂合并,加水8倍量,加热回流提取2小时,滤过,药渣加水6倍量,加热回流提取1小时,滤过,将两次水提液合并,减压浓缩至含生药量3 g/ml,加乙醇至醇浓度为60%,静置12小时,将上清液过滤,与醇提液合并,减压浓缩得稠膏中间体,备用。崩漏停化学成分研究:中药复方物质基础研究建立在充分了解所含化学成分的基础上,因此本部分通过指纹图谱与血清药物化学相结合的方法,找出特征峰所代表的化学成分与入血成分的交集,缩小药效物质基础范围。(1)崩漏停指纹图谱研究:由于复方中化学成分复杂,故采用HPLC-UV-ELSD建立崩漏停指纹图谱。对洗脱条件、流动相、紫外检测波长、蒸发光散射检测器漂移管温度、雾化体积流量等条件进行优化,最终确定的色谱条件为Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6mm×4.6mm,5μm),流动相乙腈(B)-0.1%甲酸(C),采用梯度洗脱条件,0~10 min:5%(B)~10%(B),10~12 min:10%(B)~13%(B),12~16 min:13%(B)~15%(B),16~27 min:15%(B)~16%(B),27~37 min:16%(B)~25%(B),37~52 min:25%(B)~38%(B),52~57 min:38%(B)~45%(B),57~69 min:45%(B)~95%(B),69~77 min:95%(B)~97%(B),77~80 min:97%(B)~100%(B)。流速为 1ml·min-1,紫外检测波长 265nm,柱温为30℃,进样量10 μl。蒸发光检测器漂移管温度110℃,载气流速2.0 L·min-1,记录时间80min。结果于紫外检测器下标定27个共有峰,于蒸发光散射检测器下标定5个共有峰,其精密度、重复性、稳定性实验结果中的保留时间和峰面积RSD均小于3%,十批崩漏停供试品溶液的相似度均大于0.9。然后,将各药材图谱与崩漏停指纹图谱进行比对,对特征峰进行药材归属分析。结果显示,UV条件下,8个色谱峰来自蒲黄,3个特征峰来自五灵脂,6个色谱峰来自当归,6个色谱峰来自醋香附,1个色谱峰为蒲黄、五灵脂共有,2个色谱峰为五灵脂、醋香附共有,1个色谱峰为五灵脂、当归、醋香附共有。ELSD条件下,4个色谱峰来自三七,1个色谱峰为蒲黄、三七共有。另外,通过与混合标准品溶液色谱图进行比对,确定UV条件下,2号、4号、13号、14号、16号、26号色谱峰分别为没食子酸、原儿茶酸、香蒲新苷、阿魏酸、异鼠李素-3-0-新橙皮苷、α-香附酮,ELSD条件下,1’号、2’号及3’号色谱峰分别为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1。(2)崩漏停血中移行成分分析:中药复方中成分构成复杂,但是对于用于口服的复方来说,成分只有入血才能在体内发挥药效,因此通过血清药理学的方法,研究其入血成分。利用LC-MS对崩漏停提取液及含药血清进行化学成分分析,并找到指纹图谱特征峰与入血成分中的交集。结果显示,崩漏停提取液于负离子模式下共检测出19个成分,于正离子模式下共检测出52个成分,其中9个成分在两个模式下均能被检测到,并利用保留时间确定了指纹图谱中25个特征峰。在此基础上,将这些成分于给药血清的LC-MS图中进行检索,发现其中有17个共有成分,分别为香蒲新苷、新橙皮苷、橙皮苷、槲皮苷、柚皮素、没食子酸、原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸、藁本内酯、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd、丁烯基苯酞、α-香附酮,因此将崩漏停的药效物质基础范围缩小至该17种化学成分,但各成分药效需要后续实验进行证明。崩漏停体外药效研究:上一部分对崩漏停全方及其入血成分进行了研究,确定了其中可能是起效成分的17个成分。本部分通过拆方及单体成分对体外大鼠血浆进行给药的方式,从两个方面初步确定崩漏停发挥止血及活血双向药效的部位及成分。(1)崩漏停各拆方部分体外药效研究:将崩漏停全方分为蒲黄、五灵脂药对及三七、当归、醋香附部分,于体外对大鼠血浆进行给药,以凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)为指标,测定全方及各拆方部位在体外的止血及活血效果。结果显示,崩漏停全方及三七、当归、醋香附部分具有明显的延长凝血时间的作用,而蒲黄、五灵脂药对则呈现明显的缩短凝血时间的作用。(2)崩漏停各化学成分体外药效研究:将上述17种化学成分于体外对大鼠血浆进行给药,以PT、TT、APTT为指标,测定各化学成分在体外的止血及活血效果。结果显示,黄酮类成分及其苷元、大部分有机酸类成分可缩短凝血时间,皂苷类成分、当归中的挥发油类成分及阿魏酸可延长凝血时间,而香附中的α-香附酮则无明显影响。崩漏停网络药理学研究:在上一部分中,通过体外筛选发现17种化学成分在崩漏停发挥止血活血效果的过程中起到重要作用,因此本部分以这些成分为研究对象,利用网络药理学探究崩漏停治疗功能性子宫出血的作用机制。分析结果显示其发挥药效的机制可能与促进血管生成、参与雌激素信号通路以及干涉细胞周期有关。天然产物作为新药的重要来源,对医药发展来说一直都是必不可少的。从两栖动物的皮肤分泌物中分离出来的具有独特结构和功能的多种活性成分,尤其是多肽,在医学领域具有巨大的开发潜力。本文中,通过分子克隆从红眼树蛙(Agalychnis callidryas)中鉴定出了属于Phylloseptin家族的多肽,并根据其分子量将该条肽命名为QUB-1541。然后,通过固相合成的方法成功合成了成熟肽,并利用反相高效液相色谱(Reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)以及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass,MALDI-TOF MASS)对其进行纯化和鉴别。将纯化后的纯肽进行生物活性检测,发现QUB-1541对革兰氏阳性菌的抑制作用优于革兰氏阴性菌,其对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)为8μM而对大肠杆菌的MIC为512μM。同样,QUB-1541也可抑制真菌,白色念珠菌的生长,其MIC为128μM。对上述微生物的最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration,MBC)检测结果表明,最高浓度的QUB-1541对大肠杆菌和白色念珠菌没有杀灭作用。但是,QUB-1541在较低的16μM水平下可以杀灭金黄色葡萄球菌,并且在此浓度下,溶血作用也较弱。另外,QUB-1541也有一定的抗癌作用,但仅在l0~(-4)M下对癌细胞PC-3、U251MG、H157有效。综上,鉴于其良好的抗革兰氏阳性菌作用以及较低的溶血毒性,QUB-1541具有后续的研究价值。


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